Mitochondriales Genom und Sequenzierung der mitochondrialen DNA (mtDNA)

Überblick über das mitochondriale Genom

Das Mitochondrium ist ein unverzichtbares Organell für nahezu alle eukaryotischen Zellen. Es gibt jedoch einige Ausnahmen, wie die reifen roten Blutkörperchen. Das mitochondriale Genom ist ein doppelsträngiges, zirkuläres Molekül von etwa 16.569 bp und kodiert 37 Gene, darunter 22 tRNAs, 2 rRNAs und 13 Proteine, die Untereinheiten von Enzymkomplexen des oxidativen Phosphorylierungssystems sind. Daher ist das mitochondriale Genom sehr wichtig für die zelluläre Energiegewinnung und das Überleben. Darüber hinaus kann aufgrund der mütterlichen Vererbung mtDNA verwendet werden, um den Ursprung und die Abstammung von Eukaryoten zurückzuverfolgen.

Abbildung 1. Die Struktur des menschlichen mitochondrialen Genoms (von Wiki).

• Mitochondriales Genom und menschliche Krankheit

Mutationen in mitochondrial DNA (mtDNA) sind mit einer Vielzahl von menschlichen Krankheiten verbunden, wie Autoimmunerkrankungen, Krebs und neurodegenerativen Störungen wie Parkinson und Alzheimer. Aber warum kann ein so kleines Genom die menschliche Gesundheit so stark beeinflussen? Forscher fanden heraus, dass mtDNA stark anfällig für mutagene Angriffe durch reaktive Sauerstoffspezies ist, was zur Ansammlung somatischer Mutationen führt. In Verbindung mit der begrenzten Fähigkeit zur DNA-Reparatur in dem Organell treten Veränderungen in mtDNA viel häufiger auf als in der nukleären DNA. Darüber hinaus können eukaryotische Zellen bis zu Tausende von Mitochondrien enthalten. Die mtDNA-Heteroplasmie ist ein Indikator für eine zelluläre Stoffwechselstörung. Daher hat die Analyse des mitochondrialen Genoms an Bedeutung gewonnen.

Mitochondriale DNA-Sequenzierung

Mitochondriale DNA-Sequenzierung ist ein leistungsstarker Ansatz zur Erkennung von mtDNA-Mutationen, die mit menschlichen Krankheiten assoziiert sind, zur Bestimmung der mtDNA-Heteroplasmie, zur Erkennung epigenetischer Modifikationen und zur Haplogruppeneinstufung. Die Sanger-Sequenzierung macht die Sequenzierung von mitochondrialer DNA einfach und erschwinglich. Die Einführung von Next-Generation-Sequencing (NGS)-Technologien ist der größte Wendepunkt in der mitochondrialen Genomik. NGS kann in einer kostengünstigeren und schnelleren Weise um Größenordnungen mehr Daten generieren.

• Workflow der mitochondrialen Sequenzierung mit NGS

Der Workflow der mitochondrialen DNA-Sequenzierung umfasst folgende Schritte: Isolierung der genomischen DNA (die sowohl nukleare als auch mitochondriale DNA enthält), Anreicherung der mtDNA, Bibliotheksgenerierung, Hochdurchsatz-Sequenzierung und bioinformatische Analyse. Die mtDNA der DNA-Proben wird einzeln mittels der Long-Range-PCR-Methode amplifiziert, wobei zwei überlappende Fragmente (>8 Kb) verwendet werden. Es gibt kommerzielle Long-Range-PCR-Kits auf dem Markt, wie das Qiagen LongRange PCR Kit und das SequalPrep™ Long PCR Kit mit dNTPs. Die Long-Range-PCR ist eine flexible, effiziente und kostengünstige Methode zur Sequenzierung spezifischer genomischer Regionen, insbesondere in Kombination mit NGS-Plattformen. Diese Methode verwendet Long-Range-DNA-Polymerasen, die in der Lage sind, Sequenzen von bis zu 15 Kb oder länger zu amplifizieren. Sie ermöglicht die Amplifikation ganzer mitochondrialer Chromosomen. Nach dieser PCR wird die Agarose-Gelelektrophorese (0,7%) verwendet, um das Vorhandensein des PCR-Produkts zu bestätigen, und das PCR-Produkt wird dann quantifiziert. Anschließend werden Bibliotheken für die DNA-Fragmente, die Ligatur von Barcode-Adaptern und die Amplifikation konstruiert, gefolgt von der Bestimmung der Konzentration mit qPCR und der Sequenzierung mit Ion Torrent™ PGM™, Illumina HiSeq/MiSeq, anderen NGS-Plattformen oder Long-Read-Sequenzierungsplattformen wie PacBio RSII und Oxford Nanopore MinION™.

• Bioinformatikanalyse

Nach der Sequenzierung werden die Abdeckungsdichte und andere Parameter geschätzt und die Qualität der Reads wird für das Filtern und Trimmen bewertet. Die Ausrichtung mitochondrialer Sequenzen kann mit ClustalW durchgeführt werden, und offene Leserahmen (ORFs) sowie rRNA-Genfragmente können identifiziert und annotiert werden. Sequenzmutationen wie SNPs werden erkannt und ihre Allelfrequenz geschätzt. Der Zusammenhang zwischen Mutationen und menschlichen Krankheiten kann vorhergesagt werden. Zudem kann die tierische Phylogenie mithilfe von Maximum-Likelihood- oder Bayesian-Analyse abgeleitet werden.

Referenzen:

1. Smith D R. Die Vergangenheit, Gegenwart und Zukunft der mitochondrialen Genomik: Haben wir genug mtDNAs sequenziert? Briefings in funktioneller Genomik, 2015, 15(1): 47-54.
2. Taanman J W. Das mitochondriale Genom: Struktur, Transkription, Translation und Replikation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetik, 1999, 1410(2): 103-123.
3. Douglas A P, Vance D R, Kenny E M, u. a.Next-Generation-Sequenzierung des mitochondrialen Genoms und Assoziation mit IgA-Nephropathie in einer Nierentransplantationspopulation. Wissenschaftliche Berichte, 2014, 4: 7379.