Praktische Fallstudien zum Vergleich zwischen EM-seq und anderen Methylierungs-Sequenzierungstechnologien

Im Bereich von Epigenetik, DNA-Methylierung ist die Schlüsselinschrift der Regulierung der Genexpression, und die Entwicklung ihrer genomweiten Nachweistechnologie hat sich immer darum gedreht, wie man die Methylierungskarte effizienter und genauer analysieren kann. Traditionelles genomweites Bisulfit-Sequenzieren (WGBS) realisiert die Methylierungserkennung mit Einzelbasenauflösung durch Bisulfit-Transformation, sieht sich jedoch den Einschränkungen einer erheblichen DNA-Zersetzung und hohen Eingabebedarf gegenüber. Mit dem raschen Anstieg der Forschungsanforderungen für Proben mit niedrigem Input, enzymatische Methylierungssequenzierung (EM-seq) hat sich in der Methylierungsanalyse von Spuren-DNA durch die milde Behandlung von DNA mittels enzymatischer Umwandlung herausgebildet.

Gleichzeitig passt sich die Post-Bisulfid-Markierungstechnologie (PBAT) an extrem niedrige Eingabeszenarien wie Einzelzellen an, indem der Prozess des Bibliotheksaufbaus optimiert wird, während die Oxford-Nanopore-Sequenzierung Technologie bietet eine neue Dimension für die Methylierungsanalyse mit dem Vorteil von langen Lesungen und großer Länge. Diese Technologien haben ihre Vorteile im Transformationsprinzip, in der Datenqualität und in den Anwendungsszenarien, und es ist von großer Bedeutung, ihre Unterschiede zu klären, um die epigenetische Forschung und die klinische Transformation voranzutreiben.

Dieses Papier vergleicht die Leistung von EM-seq mit anderen Technologien zur DNA-Methylierungserkennung und hebt die Vorteile von EM-seq bei niedrigem DNA-Eingang und GC-reichen Regionen sowie dessen Anwendung in der Pflanzen- und klinischen Forschung hervor.

Kurze Einführung in verschiedene Methylierungstechnologien

Im Nachweisverfahren der DNA-Methylierung schützt EM-seq die DNA durch enzymatische Umwandlung, die für GC-reiche Regionen geeignet ist. WGBS wird mit Bisulfit behandelt, was den Goldstandard für die genomweite Methylierungsdetektion darstellt, jedoch eine GC-Bias aufweist. Der EPIC-Chip ermöglicht die gezielte Detektion von über 930.000 CpG-Stellen und ist für große Proben geeignet; die direkte Sequenzierung mit ONT hat keine GC-Bias, und ihre lange Leselänge ist für komplexe Regionen geeignet, wobei jede Methode ihre eigenen Vor- und Nachteile hat.

EM-seq

PrinzipDie enzymatische Reaktion wurde anstelle der Bisulfitbehandlung verwendet. Zunächst wurde methylierte Cytosin (5mC) durch das TET2-Enzym zu Derivaten wie 5-Hydroxymethylcytosin oxidiert, und dann wurde unmethylierte Cytosin durch das APOBEC-Enzym in Uracil umgewandelt. Schließlich wurde die unmethylierte Stelle als Thymin (T) angezeigt und die methylierte Stelle als Cytosin (C) beibehalten.

VorteileVermeidung von DNA-Abbau durch Bisulfit, gleichmäßigere Abdeckung GC-reicher Bereiche, Eignung für DNA mit niedrigem Input (wie pg-Qualität) und genauere Quantifizierung der Methylierung.

NachteileDer experimentelle Prozess ist lang (2-4 Tage), und die Kosten sind höher als bei WGBS, daher muss er an die Illumina-Sequenzierungsplattform angepasst werden.

WGBS

PrinzipKlassische Methode: DNA wurde mit Bisulfit behandelt, unmethyliertes Cytosin wurde in Uracil umgewandelt, methyliertes Cytosin blieb erhalten, und methylierten Stellen wurden nach der Sequenzierung durch Vergleich identifiziert.

VorteileDie Technologie ist ausgereift und kann die Einzelbasisauflösung des gesamten Genoms abdecken, mit umfangreichen Daten und relativ niedrigen Kosten.

NachteileDie Bisulfidbehandlung führt zu DNA-Fragmentierung, unzureichender Abdeckung von GC-reichen Regionen, einer leichten Überschätzung des Methylierungsniveaus und hohen Anforderungen an die DNA-Eingabe (100 ng+).

Methylierte DNA ist in WGBS-Daten angereichert (Ji et al., 2014).

EPISCH

PrinzipBasierend auf Mikroarray-TechnologieDie Sonde zielte auf etwa 935.000 CpG-Stellen ab (hauptsächlich verteilt in Genpromotoren, kodierenden Regionen und anderen funktionalen Bereichen), und der Methylierungsgrad wurde durch Fluoreszenzsignale nachgewiesen.

VorteileNiedrige Kosten, geeignet für Analysen mit großen Stichprobengrößen, standardisierter Versuchsablauf und einfache Datenanalyse.

NachteileDer Sonden ist voreingestellt, was bedeutet, dass sie nicht das gesamte Genom abdecken kann, und die Sonde in GC-reichen Regionen neigt zur Kreuzhybridisierung, was zu einer Überschätzung führt, und sie kann den extremen Methylierungszustand (Beta-Wert nahe 0 oder 1) nicht nachweisen.

ONT

PrinzipDie direkte Sequenzierungstechnologie kann methyliertes Cytosin von unmethyliertem Cytosin durch die Veränderung des Nanoporenstroms unterscheiden und kann den Methylierungszustand von langen DNA-Strängen ohne chemische Umwandlung direkt lesen.

VorteileLange Leselängen (auf kb-Ebene), kein GC-Bias, geeignet für komplexe Genomregionen (wie repetitive Sequenzen und Regionen mit hohem GC-Gehalt) sowie schnelle Sequierungsgeschwindigkeit (Echtzeit-Datenoutput).

NachteileDie Kosten sind relativ hoch, und in einigen Szenarien gibt es noch Spielraum für Verbesserungen bei der Datengenauigkeit; die Anforderungen an die Probenqualität sind streng, und Proben von geringer Qualität können die Nachweiseffizienz beeinträchtigen.

Struktur des Oxford Nanopore (Levkova et al., 2023)

Vergleich von EM-seq und anderen Technologien

Im Bereich der DNA-Methylierungsdetektion unterscheidet sich EM-seq als neue Technologie erheblich von traditionellen Methoden. Im Vergleich zur Abhängigkeit von Bisulfit bei WGBS, was zu DNA-Abbau und GC-Bias führt, ist der EPIC-Chip durch die vordefinierten Sonden begrenzt, und ONT sieht sich Problemen der Analysekomplexität und Kosten gegenüber. EM-seq balanciert Genauigkeit und Abdeckung durch enzymatische Umwandlung, insbesondere in GC-reichen Regionen, was eine neue Wahl für die Methylierungsforschung bietet.

Vergleich von EM-seq und PBAT in der Methylierungsanalyse

Titel: Vergleich von EM-seq- und PBAT-Methylom-Bibliotheksmethoden für DNA mit niedrigem Input

Veröffentlichen Magazin: Epigenetik

Impact-Faktoren: 2,9

Veröffentlichungsdatum: 17.10.2022

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In dieser Studie wurden EM-seq und PBAT in vielen Dimensionen durch systematische Experimente verglichen. In Bezug auf die Sequenzierungsdaten-Ausgabe zeigt EM-seq eine höhere Bibliotheksumwandlungsrate, und die effektive Sequenzierungsdaten-Ausgabe ist bei der gleichen Ausgangsmenge von 10 ng DNA etwa 25 % höher als bei PBAT. In der Genauigkeit der Methylierungsstellenerkennung beträgt der Pearson-Korrelationskoeffizient zwischen dem quantitativen Methylierungsniveau von PBAT am CG-Stelle und der traditionellen WGBS-Methode 0,92, was leicht höher ist als der von EM-seq, der 0,89 beträgt.

In CHG- und CHH-Stellen hat EM-seq jedoch einen signifikanten Vorteil in der Nachweisempfindlichkeit und kann 18 % seltener Methylierungsstellen identifizieren, die von PBAT übersehen wurden. Darüber hinaus ist im Wiederholbarkeitsevaluation von wiederholten Proben der intra-gruppenkorrelationskoeffizient (ICC) der beiden Methoden höher als 0,85, was auf eine gute Stabilität hinweist. Bei der Datenanalyse ist die GC-Präferenz der PBAT-Sequenzierungsdaten gering, was die Schwierigkeit der nachfolgenden Korrektur verringert; jedoch schneidet EM-seq bei der Erkennung von Methylierungssignalen in Regionen mit niedriger Komplexität aufgrund seines einzigartigen enzymatischen Reaktionsmechanismus besser ab.

EM-seq-Bibliotheken schnitten besser in Bezug auf Bibliotheks- und Sequenzierungsqualität ab (Han et al., 2022).

Basierend auf dem Mechanismus der enzymatischen Transformation vermeidet die EM-seq-Technologie effektiv die starke Zersetzung von DNA, die durch die traditionelle Bisulfitbehandlung verursacht wird, durch die Kaskadenreaktion von methylierungsempfindlicher DNA-Glykosylase und Deaminase. Die Forschungsdaten zeigen, dass die durchschnittliche Einfügungsgröße von DNA-Fragmenten nach der EM-seq-Behandlung 300-500 bp erreichen kann, was die Genauigkeit des Vergleichs zwischen Sequenzierungsreads und Referenzgenom im Vergleich zu 100-200 bp nach der Bisulfitbehandlung erheblich verbessert. Unter der Bedingung eines DNA-Eingangs von 1-10 ng kann die Bibliothekswiederholungsrate unter 10 % kontrolliert werden, und die Datenkomplexität erhöht sich um mehr als 30 % im Vergleich zur traditionellen Methode, wodurch die Einheitlichkeit der Genomabdeckung sichergestellt wird. Diese Technik ist besonders geeignet für die Behandlung wertvoller Spurenproben.

Die PBAT-Technologie basiert auf dem traditionellen chemischen Transformationsprozess von Bisulfit, der zu einer Deaminierung von DNA führt, was die Fragmentierung erhöht, insbesondere bei niedrigen Ausgangsproben, und dieser Fragmentierungseffekt ist ausgeprägter. Wenn die Eingangsmenge an DNA weniger als 50 ng beträgt, überschreitet die Wiederholungsrate der PBAT-Bibliothek oft 25 %, was viele Sequenzierungsdaten überflüssig macht und die effektive Abdeckungstiefe verringert. Darüber hinaus neigt fragmentierte DNA während der Amplifikation dazu, bevorzugt behandelt zu werden, was zu einer unzureichenden Abdeckung bestimmter genomischer Regionen (wie Promotorregionen, die reich an CpG-Inseln sind) führt. Trotz dieser Einschränkungen hat die PBAT-Technologie aufgrund ihres Auflösungs-Vorteils auf Einzelzellebene weiterhin einen unverzichtbaren Anwendungswert in der Forschung, die die Methylierungsheterogenität einer einzelnen Zelle analysieren muss, wie beispielsweise in der Forschung zur frühen Embryonalentwicklung.

CpG-Abdeckung und Überlappung (Han et al., 2022)

Bei der Analyse der gesamten Genom-Methylierung mit geringem Input wird zunächst die EM-seq-Technologie empfohlen, insbesondere für klinische Forschungen mit extrem knappen Probenquellen, wie Biopsiegewebe von Krebspatienten, chorionische Proben aus der pränatalen Diagnostik oder spurenhafte Körperflüssigkeitsproben seltener Patienten. Wenn das Forschungsziel auf die Methylierungseigenschaften auf Einzelzellebene fokussiert ist und eine hohe Datenredundanz akzeptiert werden kann, kann die PBAT-Technologie als Alternative verwendet werden. Darüber hinaus wird empfohlen, die Vorteile der beiden Technologien in der praktischen Anwendung zu kombinieren, zum Beispiel indem EM-seq- und PBAT-Datenbanken für denselben Probenstamm eingerichtet werden und die dualen Ziele der genomweiten Abdeckung und der Einzelzellauflösung durch Datenintegration erreicht werden.

Korrelation der DNA-Methylierungsniveaus. Heatmaps, die die Koeffizienten zwischen den Eingabemengen (1, 2, 5 und 10 ng) und den Bibliotheksmethoden (EM-seg und PBAT) veranschaulichen. CpGs, die mit mindestens 5X und 10X abgedeckt sind, wurden berücksichtigt (Han et al., 2022).

EM-seq übertrifft WGBS bei der Erkennung des Methylierungsniveaus

Titel: Effiziente und genaue Bestimmung von genomweiten DNA-Methylierungsmustern in Arabidopsis thaliana mit enzymatischer Methylsequenzierung

Veröffentlichen Magazin: Epigenetik Chromatin

Impact Faktoren: 4,2

Veröffentlichungsdatum: 07.10.2020

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In dieser Studie wurde die Leistung von EM-seq und WGBS bei der Erkennung von DNA-Methylierung mit niedrigem Input in Arabidopsis thaliana aus mehreren Dimensionen verglichen und analysiert. In Bezug auf die Nachweisempfindlichkeit ist die Effizienz von EM-seq beim Erfassen von Methylierungsstellen in DNA-Proben mit nur 10 ng DNA deutlich höher als die von WGBS, insbesondere im Kontext von CG, CHG und CHH; die Anzahl der von ersterem erfassten Methylierungsstellen ist im Durchschnitt um 32 % höher als die von letzterem. Die Bewertung der Datenkonsistenz zeigt, dass die Korrelation des Methylierungsniveaus zwischen den beiden Technologien in hochgradigen DNA-Proben 0,89 erreichen kann.

Allerdings sank bei einer anfänglichen DNA-Menge von unter 50 ng die technische Wiederholbarkeit von WGBS erheblich (CV-Wert stieg um 45%), während EM-seq eine stabile Nachweisleistung beibehielt. Darüber hinaus liegt die Fehlerrate bei der Beurteilung des Methylierungsstatus von EM-seq unter Bedingungen mit niedrigem Input bei nur 2,1%, was fast 64% niedriger ist als die 5,8% von WGBS, was besonders auffällig ist bei der Analyse von gewebespezifischen Methylierungsmustern. Basierend auf den oben genannten Ergebnissen zeigt EM-seq eine höhere Zuverlässigkeit und Nachweis-effizienz bei der Erkennung von DNA-Methylierung mit niedrigem Input in Arabidopsis thaliana.

Qualitätsvergleich zwischen EM-seq und WGBS (Feng et al., 2020)

EM-seq kann mit seinem milden Enzymtransformationssystem auch bei einer niedrigen Anfangsprobe von 5 ng eine hohe Gleichmäßigkeit der CpG-Stellenabdeckung aufrechterhalten und somit den Informationsverlust durch DNA-Abbau effektiv reduzieren. Im Gegensatz dazu zeigt WGBS zwar die Vorteile des traditionellen Goldstandards bei hochgradigen Proben, hat jedoch offensichtliche GC-Präferenzen und Probleme mit Sequenzverlusten in Szenarien mit niedriger Eingabe. Aus der Perspektive der Datenanalyse erzeugt EM-seq weniger Hintergrundrauschen und kann den Methylierungsstatus von CHH- und CHG-Stellen genauer identifizieren, was einen zuverlässigen Weg bietet, das Methylierungsmuster von non-CG zu untersuchen.

Es ist erwähnenswert, dass die beiden Techniken eine hohe Konsistenz bei der Erkennung der Methylierungslevels von CHG- und CG-Stellen zeigten (R²=0,89), während die Ergebnisse der Detektion an CHH-Stellen signifikant unterschiedlich waren (p<0,01), was auf die schädliche Wirkung der Bisulfit-Transformation von WGBS auf einzelsträngige DNA zurückzuführen sein könnte. In Bezug auf die experimentellen Kosten hat EM-seq ein höheres umfassendes Kosten-Nutzen-Verhältnis, wenn es um wertvolle oder spärliche Proben geht, da keine zusätzlichen Schritte zur DNA-Amplifikation erforderlich sind.

Vergleich der Abdeckung zwischen EM-seq und WGBS (Feng et al., 2020)

Zusammenfassend kann EM-seq als die bevorzugte Nachweistechnologie für die Untersuchung von DNA-Methylierung bei niedrigem Input in Arabidopsis thaliana und anderen Modellpflanzen verwendet werden, insbesondere für die Analyse von Proben im frühen Entwicklungsstadium, DNA, die aus einzelnen Zellen stammt, oder degradierten Proben. Zukünftige Forschungen können das Anwendungspotenzial von EM-seq in anderen Arten und komplexen biologischen Prozessen weiter erkunden und die gemeinsame Analyse von Methylierungsstellen und Chromatinstruktur durch die Kombination von Langlesetechnologie und Langsequenzierung realisieren.

Unterschiede in differentially methylated regions (DMRs) zwischen EM-seq und WGBS (Feng et al., 2020)

Auswahl der geeigneten Technologie basierend auf den Forschungsanforderungen

Titel: Vergleich der Methilierungsniveaus, die in GC-reichen Regionen mit aktuellen und aufkommenden Methoden gemessen wurden

Veröffentlichen Sie die Zeitschrift: BMC Genomics

Impact Faktoren: 3,5

Veröffentlichungsdatum: 30.07.2024

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In der Konsistenzstudie zur genomweiten Methylierungsdetektion wurde festgestellt, dass die gemessenen Methylierungs-Beta-Werte der vier Methoden hoch korreliert sind. Der Korrelationskoeffizient r zwischen EM-seq und WGBS liegt dabei zwischen 0,826 und 0,906, während der Korrelationskoeffizient r zwischen EPIC und EM-seq über 0,96 beträgt, was darauf hinweist, dass verschiedene Detektionsmethoden sich im Gesamtrend gut gegenseitig bestätigen können. Es ist erwähnenswert, dass aus der Sicht der intra-gruppenspezifischen Stabilität die intra-gruppenspezifische Korrelation von EM-seq 0,885 ± 0,007 erreichte, was signifikant überlegen war im Vergleich zu WGBS (0,844 ± 0,007) hinsichtlich der Stabilität der wiederholten Testergebnisse. Der Unterschied wurde statistisch getestet (p<0,05), was bestätigte, dass EM-seq in der intra-gruppenspezifischen Wiederholbarkeit besser abschnitt.

Die Methylierungsniveaus pro Position, die mit EM-seq, WGBS und EPlC untersucht wurden, sind gut korreliert und weitgehend unabhängig vom GC%-Kontext (Guanzon et al., 2024).

In den Regionen mit unterschiedlichen GC-Gehalten im Genom zeigen die einzelnen Nachweismethoden deutliche Leistungsunterschiede. Die EM-seq-Technologie schnitt in der Hoch-GC-Region mit einem GC-Gehalt von 55-95% gut ab, und ihre Abdeckung war signifikant höher als die von WGBS (p<0,01), was auf ihren einzigartigen enzymatischen Behandlungsmechanismus zurückzuführen ist, der effektiv die Amplifikationshindernisse in der Hoch-GC-Region überwinden kann. WGBS zeigt jedoch einen schwachen Vorteil in der Niedrig-GC-Region mit einem GC-Gehalt von unter 35%, und ihre Abdeckung ist leicht höher als die von EM-seq. Darüber hinaus wird der Methylierungsgrad der EPIC-Technologie in der Region mit einem GC-Gehalt von über 75% überschätzt. Eine eingehende Analyse zeigt, dass 8,5% der in dieser Technologie verwendeten Hoch-GC-Sonden Probleme mit Kreuzreaktionen aufweisen, die zu Fehlinterpretationen der Nachweissignale führen können, was zu einer ungenauen Bewertung des Methylierungsgrades führt.

Die Methylierungslevels sind in allen biologisch relevanten genomischen Kontexten gut korreliert zwischen EM-seg WGBS und EPlC (Guanzon et al., 2024).

EM-seq und ONT zeigten signifikante Vorteile bei der Methylierungsdetektion von GC-reichen Regionen. EM-seq vermeidet die Amplifikationspräferenz der traditionellen Bisulfitbehandlung für hoch GC-reiche Regionen durch eine einzigartige enzymatische Modifikation und ermöglicht eine genaue Quantifizierung mit einer Auflösung auf Einzelbasenebene, was besonders geeignet ist für die präzise Bewertung des Methylierungsniveaus von Tumormarkern. ONT, basierend auf der Nanoporen-Sequenzierungstechnologie, kann die Methylierungsinformationen von langen DNA-Fragmenten (> 10 kb) direkt lesen, was eine unersetzliche Rolle bei der unvoreingenommenen Analyse komplexer Genomstrukturregionen (wie Gencluster und wiederholte Sequenzen) spielt.

Im Gegensatz dazu ist die Abdeckung von WGBS erheblich reduziert (im Durchschnitt etwa 30%), aufgrund der geringen Deaminierungseffizienz von Bisulfit bei hoch GC-reichen Sequenzen, während der Erkennungsblindbereich des EPIC-Chips etwa 20% beträgt, bedingt durch die Einschränkung des Proben-Designs. Dennoch bleibt die genomweite Abdeckung von WGBS und die niedrigen Kosten von EPICs Qualcomm dominant in der routinemäßigen Methylierungsüberprüfung großer Stichprobenkohorten. Die Forschungsergebnisse bieten einen quantitativen Referenzstandard für die Auswahl von Methylierungsnachweismethoden in verschiedenen Szenarien wie grundlegender wissenschaftlicher Forschung und klinischer Diagnose.

Die richtige Wahl des Werkzeugs für die Aufgabe (Guanzon et al., 2024)

Fazit

Zusammenfassend hat EM-seq seine einzigartigen Vorteile bei der Methylierungsdetektion durch den Schutz der DNA-Integrität und die gleichmäßige Abdeckung von GC-reichen Regionen durch enzymatische Umwandlung gezeigt. Im Vergleich zu den Bisulfitverzerrungen von WGBS, den Probenbeschränkungen des EPIC-Chips und den hohen Kosten sowie der Komplexität von ONT hat EM-seq eine bessere Balance zwischen Genauigkeit und Praktikabilität erreicht und ist besonders geeignet für die eingehende Untersuchung von GC-reichen Regionen wie CpG-Inseln. Mit der kontinuierlichen Optimierung der Technologie wird erwartet, dass EM-seq eine wichtigere Rolle bei der Entdeckung von epigenetischen Krebsmarkern und der Mechanismusanalyse von Ein-Gendiseasen spielt und zuverlässigere technische Unterstützung für die epigenetische Forschung bietet.

Referenzen:

1. Ji L, Sasaki T, Sun X, Ma P, Lewis ZA, Schmitz RJ. "Methylierte DNA ist überrepräsentiert in Daten zur Bisulfid-Sequenzierung des gesamten Genoms." Front Genet. 2014 5: 341 Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von externen Links übersetzen. Bitte geben Sie den Text ein, den Sie übersetzen möchten.
2. Levkova M, Chervenkov T, Angelova L, Dzenkov D. "Oxford Nanopore-Technologie und ihre Anwendung in Flüssigbiopsien." Aktuelle Genomik2023 24(6): 337-344 Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von externen Links übersetzen. Bitte geben Sie den Text ein, den Sie übersetzt haben möchten.
3. Han Y, Zheleznyakova GY, Marincevic-Zuniga Y u. a. "Vergleich der EM-seq- und PBAT-Methylom-Bibliotheksmethoden für DNA mit niedrigem Input." Epigenetik2022 17(10): 1195-1204 Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von externen Links oder DOI-Nummern übersetzen. Bitte geben Sie den Text ein, den Sie übersetzt haben möchten.
4. Feng S, Zhong Z, Wang M, Jacobsen SE. "Effiziente und genaue Bestimmung von genomweiten DNA-Methylierungsmustern in Arabidopsis thaliana mit enzymatischer Methylsequenzierung." Epigenetik Chromatin2020 13(1): 42 Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von externen Links übersetzen. Bitte geben Sie den Text ein, den Sie übersetzt haben möchten.
5. Guanzon D, Ross JP, Ma C, Berry O, Liew YJ. "Vergleich der Methylierungsniveaus, die in GC-reichen Regionen mit aktuellen und aufkommenden Methoden bestimmt wurden." BMC Genomik2024 25(1): 829 Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von externen Links übersetzen. Bitte geben Sie den Text ein, den Sie übersetzt haben möchten.