Eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur EM-Seq: Von der DNA-Extraktion bis zur Methylierungsanalyse

Enzymatische Methyl-seq (EM-seq), als eine innovative und effiziente Technologie, tritt allmählich in den Vordergrund der Genomforschung und bietet ein leistungsstarkes Werkzeug für die eingehende Analyse des Geheimnisses von DNA-MethylierungDer Prozess der EM-seq ist präzise und rigoros, und integriert eine Reihe von fortschrittlichen experimentellen Operationen und wissenschaftlichen Prinzipien. Vom anfänglichen Verarbeiten der Proben bis zur genauen Erfassung der endgültigen Daten spielt jeder Schritt eine Schlüsselrolle bei der genauen Offenlegung von DNA-Methylierungsmustern.

In diesem Papier wird der EM-seq-Workflow im Detail vorgestellt, einschließlich Probenvorbereitung, chemischer Modifikation, Bibliothekskonstruktion, Sequenzierungsschritten und Datenanalyse, wobei seine wichtige Rolle und Anwendungspotenzial in der biologischen Forschung aufgezeigt werden.

Ein Schema des EM-seq-Workflows (Olova et al., 2023)

EM-seq Probenvorbereitung

Im EM-seq-Experiment ist die Probenvorbereitung ein sehr kritischer erster Schritt, und ihre Qualität steht in direktem Zusammenhang mit der Genauigkeit und Zuverlässigkeit der nachfolgenden experimentellen Ergebnisse. Vom Erhalt biologischer Proben bis zur Verarbeitung dieser Proben zu EM-seq-tauglichen Proben muss jeder Schritt strikt dem Standardprozess folgen und viele Details kontrollieren, um sicherzustellen, dass die DNA-Methylierungsinformationen in den Proben vollständig und genau erhalten und analysiert werden können.

Probenarten und -quellenEs gibt verschiedene Arten von Proben, die im EM-Seq-Prozess verwendet werden können. Zelllinien sind eine der häufig verwendeten Proben. Aufgrund ihrer relativ homogenen Eigenschaften ist es sehr praktisch, die epigenetischen Merkmale spezifischer Zelltypen zu untersuchen. Bei der Untersuchung des epigenetischen Regulationsmechanismus von Immunzellen, um den Prozess der Immunantwort zu verstehen, können die entsprechenden Immunzelllinien ausgewählt werden. Gewebeproben decken ein breites Spektrum ab, und Tumorgewebeproben sind in der epigenetischen Forschung zu Krebs von großer Bedeutung. Durch die Analyse epigenetischer Modifikationen wie DNA-Methylierung in Tumorgeweben können wir den molekularen Mechanismus des Auftretens und der Entwicklung von Tumoren aufdecken und wichtige Hinweise für die Früherkennung, die Beurteilung der Prognose und die Entdeckung therapeutischer Ziele bei Krebs liefern.

Vorsichtsmaßnahmen für die Probenentnahme und -lagerungAlle Arten der Probenentnahme sollten der spezifischen besten Methode und Gelegenheit folgen. Tumorgewebeproben sollten so schnell wie möglich nach der chirurgischen Resektion entnommen werden, um epigenetische Modifikationen der Tumorzellen aufgrund von Ischämie und anderen Faktoren zu vermeiden. Es wird allgemein empfohlen, die Entnahme innerhalb von 30 Minuten nach der In-vitro-Entnahme abzuschließen. Bei der Entnahme sollte sichergestellt werden, dass die Entnahmestelle repräsentativ ist, und es sollte versucht werden, eine Vermischung mit normalem Gewebe zu vermeiden. Gewebeproben können nach der Entnahme schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren werden, um ihre epigenetischen Modifikationen in vivo zu erhalten. Blutproben werden normalerweise durch intravenöse Blutentnahme gesammelt, wobei Blutentnahmeröhrchen mit Antikoagulanzien verwendet werden. Nach der Blutentnahme sollten sie vorsichtig umgedreht und rechtzeitig gleichmäßig gemischt werden, um eine Blutgerinnung zu verhindern.

NukleinsäureextraktionJe nach Probenart sollten geeignete Methoden zur Nukleinsäureextraktion ausgewählt werden. Für Zelllinienproben wird häufig die Silicagel-Säulenadsorptionsmethode verwendet, die einfach und schnell zu handhaben ist, die Nukleinsäureextraktion in kurzer Zeit abschließen kann und sich für die Quantitätsversuche von Qualcomm eignet. Allerdings kann es bei dieser Methode während der Elution zu einem gewissen Verlust von Nukleinsäure kommen. Die Phenol-Chloroform-Methode wird häufig zur Extraktion von Nukleinsäure aus Gewebeproben verwendet. Die mit dieser Methode extrahierte Nukleinsäure hat eine hohe Reinheit und kann effektiv Verunreinigungen wie Proteine entfernen. Die Arbeitsschritte sind jedoch kompliziert, und es sind toxische Reagenzien wie Phenol und Chloroform erforderlich, was spezielle Fertigkeiten der Experimentatoren erfordert.

QualitätskontrolleSchlüsselindikatoren sind Konzentration, Reinheit und Integrität. Die Konzentration wird mit einem Spektrophotometer bestimmt. Nachdem die Nukleinsäureprobe auf ein geeignetes Vielfaches verdünnt wurde, wird sie in ein Spektrophotometer gegeben, um die Absorption bei einer Wellenlänge von 260 nm zu messen, und die Nukleinsäurekonzentration wird gemäß dem Lambert-Beer-Gesetz berechnet. Die Reinheit wird durch das Verhältnis von A260/A280 und A260/A230 gemessen. Das Verhältnis von A260/A280 reiner DNA-Proben sollte zwischen 1,8 und 2,0 liegen. Wenn das Verhältnis unter 1,8 liegt, kann es zu einer Proteinverunreinigung gekommen sein. Wenn das Verhältnis über 2,0 liegt, kann es zu einer RNA-Verunreinigung gekommen sein. Das Verhältnis von A260/A230 sollte zwischen 2,0 und 2,2 liegen. Wenn das Verhältnis zu niedrig ist, können Verunreinigungen wie Polysaccharide und Polyphenole vorhanden sein. Die Integrität der Nukleinsäure wurde beurteilt, indem die Integrität der Banden durch Agarose-Gelelektrophorese beobachtet wurde. Nachdem die Nukleinsäureprobe mit dem Ladepuffer gemischt wurde, wird sie in die Ladeöffnung des Agarosegels gegeben, und die Elektrophorese wird bei einer geeigneten Spannung durchgeführt. Wenn die Banden vage und diffus sind, deutet dies darauf hin, dass die Integrität der Nukleinsäure schlecht ist und möglicherweise degradiert wurde, was die nachfolgenden EM-Seq-Experimentergebnisse beeinträchtigen kann.

Die Qualitätskontrolle der EM-seq und BS-seq (Wang et al., 2022)

Chemische Modifikation in der EM-seq

Der chemische Modifikationsprozess von EM-seq ist keine direkte chemische Veränderung der DNA-Basen im traditionellen Sinne, sondern eine Reihe gut geplanter enzymatischer Reaktionen, um eine effiziente Kennzeichnung und genaue Erkennung spezifischer Methylierungsstellen zu erreichen. Dieses chemische Modifikationsverfahren hat einen brandneuen und potenziellen Weg eröffnet, um das Geheimnis der DNA-Methylierungsgruppe umfassend und genau zu enthüllen, was die Entwicklung verwandter Forschung erheblich gefördert hat.

Modifikationsreagenz und Reaktion

Im EM-Seq-Prozess sind die wichtigsten chemischen Modifikationsreagenzien β-Glucosyltransferase (βGT) und Bisulfit. βGT ist ein Enzym, das Glukosegruppen an 5-Methylcytosin (5mC) anfügen kann. Sein chemisches Wesen ist Protein, das durch Faltung einer spezifischen Aminosäuresequenz entsteht. In der Reaktion wurde 5-Methylcytosin-β-D-Glucosid (5mC-β-D-Glucopyranosid) gebildet, indem eine β-Glucosylgruppe an das 5. Kohlenstoffatom von 5mC durch enzymatische Reaktion angefügt wurde, was die chemische Struktur von 5mC veränderte. Seine Funktion besteht darin, 5mC zu kennzeichnen und es von unmodifiziertem Cytosin zu unterscheiden, was die Grundlage für die anschließende Bisulfitbehandlung legt.

Bisulfit spielt eine äußerst wichtige Rolle in der EM-Seq. Die chemische Struktur von Bisulfit ist HSO, das eine starke Reduzierbarkeit aufweist. Unter sauren Bedingungen kann Bisulfit mit unmodifiziertem Cytosin deaminiert werden. Der spezifische Reaktionsmechanismus besteht darin, dass das Bisulfit-Ion (HSO) zunächst mit der Aminogruppe an einer bestimmten Position des Cytosins reagiert, um ein Zwischenprodukt zu bilden. Anschließend unterliegt das Zwischenprodukt unter bestimmten Bedingungen einer Deaminierungsreaktion, wobei die Aminogruppe durch eine Hydroxylgruppe ersetzt wird, die schließlich in Uracil umgewandelt wird. Methylierungs-modifiziertes Cytosin hat jedoch keinen Einfluss auf methylierungs-modifiziertes Cytosin, da die Existenz der Methylgruppe die Additionsreaktion zwischen Bisulfit und der Aminogruppe an der spezifischen Position verhindert.

Optimierung der Reaktionsbedingungen

Während der Modifikationsreaktion haben Temperatur- und Zeitparameter signifikante Auswirkungen auf die Reaktionseffizienz und Spezifität. Die Ergebnisse zeigen, dass die Reaktionsgeschwindigkeit von Bisulfit mit unmodifiziertem Cytosin bei niedrigerer Temperatur langsam ist. Eine zu hohe Temperatur kann ebenfalls Probleme verursachen. Wenn die Temperatur 60℃ überschreitet, ist die Reaktionsgeschwindigkeit zwar extrem schnell, es kommt jedoch zu einer Überreaktion. Überreaktion ist dadurch gekennzeichnet, dass nicht nur unmodifiziertes Cytosin, sondern auch teilweise methyliertes Cytosin deaminiert wird, und die Wahrscheinlichkeit von DNA-Strangbrüchen steigt, was die Genauigkeit der nachfolgenden Sequenzierungsergebnisse ernsthaft beeinträchtigen kann. Die Konzentration des Modifizierungsreagenz ist ebenfalls sehr wichtig für den Reaktionseffekt. Wenn die Konzentration von Bisulfit zu niedrig ist, ist die Reaktion des unmodifizierten Cytosins unvollständig, und es ist unmöglich, alle unmodifizierten Basen effektiv zu kennzeichnen.

Die MDA-Amplifikation im EM-seq-konvertierten Genom (Wang et al., 2022)

EM-seq Bibliothekskonstruktion

In der Konstruktionsphase der EM-seq-Bibliothek sind Fragmentierung und Ligation der Adapter entscheidende Schritte, die direkt die Qualität der Bibliothek sowie die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der nachfolgenden Sequenzierungsergebnisse beeinflussen.

Fragmentierungsbehandlung

Physikalisches FragmentierungsverfahrenUltraschallfragmentierung dient dazu, die Fragmentierung von Nukleinsäuremolekülen durch die mechanische Wirkung von Ultraschallwellen zu realisieren. Wenn Ultraschallwellen auf eine Nukleinsäurelösung einwirken, erzeugen sie hochfrequente Vibrationen, die winzige Blasen in der Lösung bilden. Diese Blasen dehnen sich unter dem Einfluss der Ultraschallwellen schnell aus und ziehen sich zusammen und platzen schließlich, was zu einer starken Scherkräfte führt. Nukleinsäuremoleküle werden unter dem Einfluss dieser Scherkräfte in Fragmente geeigneter Größe zerbrochen.

Enzymatische VerdauungDie enzymatische Verdauung basiert auf der Erkennung und Spaltung spezifischer DNA-Sequenzen durch Restriktionsenzyme. Restriktionsendonukleasen können spezifische Nukleotidsequenzen in doppelsträngigen DNA-Molekülen erkennen, die normalerweise eine Palindromstruktur aufweisen. Sobald die Zielsequenz erkannt wird, spaltet die Restriktionsendonuklease die doppelsträngige DNA an einer spezifischen Stelle. Verschiedene Restriktionsenzyme erkennen unterschiedliche Sequenzen, sodass geeignete Restriktionsenzyme nach Bedarf ausgewählt werden können, um DNA-Fragmente mit dem erwarteten Längenbereich zu erhalten.

Verbindungsmethode

Universelle Primer-BindestelleDieser Teil der Sequenz bietet Bindungsstellen für universelle Primer in der anschließenden PCR-Amplifikation, sodass alle Fragmente in der Bibliothek effektiv in der PCR-Reaktion amplifiziert werden können. Im Sequenzierungsprozess wird der Sequenzierungsprimer mit diesem Teil der Sequenz des Linkers kombiniert, wodurch die Sequenzierungsreaktion geleitet wird und sichergestellt wird, dass die Sequenzinformationen des Nukleinsäurefragments genau gelesen werden können.

Auswahl der LigaseVerschiedene Arten von Ligase haben unterschiedliche Ligationseffizienzen und Substratpräferenzen. T4-DNA-Ligase ist eine gängige Ligase, die effizient klebrige Enden und stumpfe Enden verbinden kann. Bei der Ligation kann die Auswahl von T4-DNA-Ligase mit hoher Aktivität und guter Stabilität die Ligationseffizienz verbessern.

Reaktionstemperatur und -zeitDie Reaktionstemperatur und -zeit haben einen erheblichen Einfluss auf den Verbindungseffekt. Allgemein gesagt ist eine niedrigere Temperatur (z. B. 16℃) vorteilhaft, um das Reaktionssystem zu stabilisieren und die Genauigkeit der Verbindung zu verbessern, jedoch muss die Reaktionszeit relativ lang sein (z. B. Übernachtverbindung); Höhere Temperaturen (z. B. 25℃) führen zu einer schnelleren Reaktionsgeschwindigkeit, können jedoch zu einer geringeren Spezifität der Verbindung führen. Durch experimentelle Vergleiche wurde festgestellt, dass die Qualität und der Ertrag der verbundenen Produkte gut sind, wenn die Temperatur 16℃ für 12 Stunden beträgt.

Molare Verhältnis von Linker zu NukleinsäurefragmentDas richtige molare Verhältnis ist der Schlüssel zur Gewährleistung der Effizienz der Ligation. Wenn das molare Verhältnis von Linker zu Nukleinsäurefragment zu hoch ist, können leicht Nebenprodukte wie Linker-Dimere entstehen; ist das molare Verhältnis zu niedrig, ist die Verbindungs-effizienz gering, und einige Nukleinsäurefragmente in der Bibliothek sind möglicherweise nicht mit dem Linker verbunden. Das Optimierungsexperiment zeigte, dass das Verbindungs-ergebnis am besten war, wenn das molare Verhältnis von Linker zu Nukleinsäurefragment 5:1 betrug.

NA12878 EM-seq Bibliotheken (Vaisvila et al., 2021)

EM-seq spezifische Sequenzierungsschritte

Nach sorgfältiger Vorbereitung, wie der enzymatischen Modifikation von Proben und dem Aufbau der Bibliothek, ist die Sequenzierungsphase wie ein scharfer Informationsfänger. Mit der fortschrittlichen Sequenzierungsplattform werden DNA-Fragmente mit Methylierungsmarkern präzise gelesen. Durch eine Reihe komplexer und geordneter biochemischer Reaktionen und Signalumwandlungen werden die Basensequenz und der entsprechende Methylierungszustand in digitaler Form dargestellt, was eine solide Grundlage für die anschließende umfassende und tiefgehende Analyse von DNA-Methylierungsmustern schafft und somit das Geheimnis ihrer Regulation in biologischen Prozessen entschlüsselt.

Bibliothek wird geladenBeim Sequenzieren der EM-Seq-Bibliothek auf der ausgewählten Sequenzierungsplattform wird die vorbereitete Bibliothek zunächst in den Sequenzierungschip oder die Reaktionszelle geladen. Am Beispiel der Illumina-Plattform wird die Bibliothek durch einen speziellen Flusstank geladen, und Oligonukleotidsequenzen, die komplementär zu den Bibliotheksverbindern sind, sind auf der Oberfläche des Flusstanks fixiert. Die Bibliotheksfragmente können spezifisch an der Oberfläche des Flusstanks gebunden werden, um sich auf die anschließende Sequenzierungsreaktion vorzubereiten.

SequenzierungsreaktionszyklusFür die Sequenzierungstechnologie beim Synthesieren auf der Illumina-Plattform werden im Sequenzierungsreaktionszyklus nacheinander vier dNTPs (Desoxynukleotide) mit unterschiedlichen fluoreszierenden Markierungen in das Reaktionssystem gegeben. Die DNA-Polymerase fügt dNTPs zur Primerverlängerungskette hinzu, und jedes Mal, wenn eine Base hinzugefügt wird, identifiziert sie den Basistyp anhand des Fluoreszenzsignals und zeichnet ihn auf. Nach vielen Zyklen wurde das gesamte Bibliotheksfragment sequenziert.

DatenerfassungBei der Sequenzierungsreaktion erfasst das Instrument die Fluoreszenzsignale in Echtzeit und wandelt sie in entsprechende Basensequenzinformationen um. Die Sequenzierungsdaten werden schließlich im FASTQ-Format gespeichert.

Bewertungsindikatoren und -methodenDie ursprünglichen Sequierungsdaten wurden vorläufig mit der FastQC-Software ausgewertet. In Bezug auf die Basenmasseverteilung erstellt FastQC eine Massverteilungskarte, indem der durchschnittliche Massenanteil der Basen an jeder Position berechnet wird.

QualitätsfilterstandardSetzen Sie den Qualitätsfilterstandard gemäß dem Bewertungsergebnis. Im Allgemeinen werden Basen mit einem Basis-Massenanteil von weniger als 20 (entsprechende Fehlerrate von etwa 1%) als niedrigqualitative Basen betrachtet. Wenn der Anteil der niedrigqualitativen Basen in einer Sequenz einen bestimmten Schwellenwert (z. B. 20%) überschreitet, wird die Sequenz als niedrigqualitativ angesehen und entfernt. Bei mit Linkern kontaminierten Sequenzen werden Sequenzen, die Linker enthalten, identifiziert und entfernt, indem bekannte Linker-Sequenzen verglichen werden.

Cytosin-Methylierung an wichtigen genomischen Merkmalen (Vaisvila et al., 2021)

Wie man EM-seq-Daten analysiert

Durch die tiefgreifende Ausgrabung und Analyse komplexer Daten können wir nicht nur die dynamischen Veränderungen der DNA-Methylierung im Prozess der Zell-Differenzierung und -Entwicklung verstehen, sondern auch Methylierungsmerkmale finden, die eng mit dem Auftreten und der Entwicklung von Krankheiten im Bereich der Krankheitsforschung, wie Krebs und neurodegenerative Erkrankungen, verbunden sind. Dies bietet somit eine solide Datenunterstützung und theoretische Grundlage für die frühzeitige Diagnose von Krankheiten und die Entwicklung präziser Behandlungsstrategien.

Identifizierung von ÄnderungsstandortenDas algorithmische Prinzip zur Identifizierung epigenetischer Modifikationsstellen in EM-Seq-Daten basiert auf dem Vergleich der Eigenschaften von Nukleinsäuresequenzen vor und nach der Modifikation in den Sequenzierungsdaten. In EM-Seq führt die Methylierungsmodifikation dazu, dass die Signalmerkmale der Nukleinsäuresequenzen sich von denen der unmodifizierten Sequenzen nach einer spezifischen Behandlung unterscheiden. Durch die Analyse der Sequenzierungsdaten wurde der Methylierungsstatus jedes Locus mittels statistischer Methoden und maschineller Lernmodelle beurteilt.

Verteilung und Musteranalyse von ModifikationsstellenVerschiedene genomische Regionen werden berücksichtigt, wenn die Verteilung der identifizierten epigenetischen Modifikationsstellen im Genom statistisch analysiert wird. Im Genbereich umfasst dies Promotor, Exon und Intron. Der Methylierungsstatus der Promotorregion steht normalerweise in engem Zusammenhang mit der Regulierung der Genexpression, und Hypermethylierung hemmt oft die Gentranskription. Durch die Zählung der Verteilung von Methylierungsstellen in der Promotorregion können wir herausfinden, welche Genpromotoren möglicherweise durch Methylierung reguliert werden. In den Exon- und Intronregionen hat die Methylierungsverteilung ebenfalls ihre eigenen Merkmale, die den Spleißprozess von mRNA beeinflussen können.

Integrationsanalyse mit anderen Omics-DatenDurch die Integration von EM-Seq-Daten mit anderen Omics-Daten können wir den Mechanismus der epigenetischen Modifikation im biologischen Prozess vollständig verstehen. Die Integration mit Transkriptomdaten Als Beispiel können wir durch die Korrelationsanalyse der Veränderungen von Methylierungsstellen und Genexpressionsniveaus die Schlüssengene identifizieren, die möglicherweise epigenetisch reguliert werden. Im Allgemeinen ist das Expressionsniveau von Genen mit hoher Methylierung in der Promotorregion oft niedrig; hingegen kann das Expressionsniveau von hypomethylisierten Genen höher sein.

EM-seq biologische Analyse

Fazit

Zusammenfassend beginnt der EM-seq-Prozess mit der DNA-Extraktion aus Proben und durchläuft eine Reihe präziser Schritte wie TET-Enzymbehandlung, terminale Reparatur und Verknüpfung von Linkern, PCR-Amplifikation usw., um schließlich eine Sequenzierungsbibliothek zu erhalten, die für eine eingehende Analyse verwendet werden kann. Mit seiner hohen Effizienz und Genauigkeit kann dieser Prozess DNA-Methylierungsmodifikationsstellen präzise nachweisen, bietet Forschern ein leistungsstarkes Werkzeug, um biologische Fragestellungen wie die Regulation der Genexpression und die Mechanismen des Auftretens und der Entwicklung von Krankheiten eingehend zu untersuchen, zeigt großes Anwendungspotenzial im Bereich der Lebenswissenschaften und treibt verwandte Forschungen ständig auf ein neues Niveau.

Referenzen:

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