EM-seq: Prinzipien, Arbeitsablauf, Anwendungen und Herausforderungen

Im weiten Feld der biologischen Wissenschaften, epigenetische Forschung wird zunehmend zu einer der zentralen Grenzen, um die Geheimnisse des Lebens zu erforschen. Epigenetische Modifikationen wie die DNA-Methylierung spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Genexpression, der Zell-Differenzierung und dem Entwicklungsprozess. Die genaue und effiziente Erkennung dieser epigenetischen Marker ist von großer Bedeutung für das Verständnis der molekularen Mechanismen von Lebensphänomenen. Vor diesem Hintergrund gewinnt die Technologie der enzymvermittelten Methylierungssequenzierung an Bedeutung.EM-seq) entstand. Mit seinem einzigartigen technischen Prinzip und offensichtlichen Vorteilen eröffnete es eine neue Ära für die Epigenetikforschung, zog in den letzten Jahren die Aufmerksamkeit vieler Forscher auf sich und förderte erheblich die Entwicklung dieses Bereichs.

EM-seq ist eine hochmoderne Technologie zur genauen Erkennung des DNA-Methylierungsniveaus. Im heutigen Bereich der Lebenswissenschaften ist es sehr wichtig, die Regulationsmechanismen der Genexpression zu erforschen, und die DNA-Methylierung, als eine der Schlüssel-Epigenetischen Modifikationen, hat viel Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Mit ihrem einzigartigen technischen Prinzip und offensichtlichen Vorteilen wird EM-seq zunehmend zu einem leistungsstarken Werkzeug für Forscher, um das Geheimnis der Methylierung tiefgehend zu analysieren.

Dieses Papier führt die enzymvermittelte Methylierungs-Sequenzierungstechnologie EM-seq ein, einschließlich ihres Prinzips, Arbeitsablaufs, technischer Vorteile und Anwendungen in der biologischen Forschung und hat breite Anwendungsperspektiven.

Das Prinzip der EM-seq

Der Kernmechanismus der EM-seq-Technologie basiert hauptsächlich auf dem synergistischen Effekt des Ten-Eleven Translocation (TET) und des APOBEC-Enzyms. Im gesamten Reaktionsprozess führte das TET-Enzym, als "führender Faktor der Oxidation", präzise chemische Modifikationen an 5-Methylcytosin (5mC) durch, dank seiner starken Oxidationsaktivität. Konkret kann das TET-Enzym 5mC schrittweise in geordneter Weise oxidieren, sodass es durch mehrere Zwischenzustände in 5-Hydroxymethylcytosin (5hmC) und 5-Aldocytosin (5fC) umgewandelt werden kann, und schließlich kann 5-Carboxycytosin (5caC) erzeugt werden. Jeder Schritt der Oxidationsreaktion ist hochpräzise und geordnet, was eine entscheidende Grundlage für den anschließenden Nachweisprozess bildet.

Zur gleichen Zeit spielt das APOBEC-Enzym eine unverzichtbare Rolle. Als "Deaminierungs-Executor" von unmodifiziertem Cytosin hat das APOBEC-Enzym eine hohe spezifische Erkennungsfähigkeit für unmodifiziertes Cytosin. Sobald das Ziel erkannt wird, führt das APOBEC-Enzym schnell seine Deaminierungsfunktion aus und wandelt unmodifiziertes Cytosin in Uracil um. Es ist erwähnenswert, dass im anschließenden PCR-Amplifikationsprozess Uracil genau als Thymin identifiziert wird, was einen entscheidenden Hinweis zur Unterscheidung zwischen methylisierten und unmethylisierten Stellen liefert. Aufgrund der relativen Stabilität seiner eigenen Struktur können 5mC und seine Oxidationsprodukte jedoch der Deaminierung durch das APOBEC-Enzym widerstehen und die Integrität ihrer eigenen Struktur aufrechterhalten.

Basierend auf den unterschiedlichen Aktionsmerkmalen dieser beiden Enzyme blieb im endgültigen Sequenzierungsergebnis die ursprüngliche Methylierungsstelle als Cytosin erhalten, da sie nicht vom APOBEC-Enzym beeinflusst wurde. Die unmethylierte Stelle wurde jedoch aufgrund der Deaminierung durch das APOBEC-Enzym und der Basenerkennungsumwandlung während der PCR-Amplifikation in Thymin umgewandelt. Durch diesen bemerkenswerten Unterschied können Forscher methylierte Stellen effektiv und genau von unmethylierten Stellen in DNA-Sequenzen unterscheiden, was eine starke technische Unterstützung für die weitere Erforschung des Mechanismus der DNA-Methylierung im Lebensprozess bietet.

Enzymatische Aktivität von Enzymen, die an der Erkennung von 5mC und 5hmC beteiligt sind (Vaisvila et al., 2021)

Wie funktioniert EM-seq?

Als neue Sequenzierungstechnologie zeigt EM-seq ein bemerkenswertes Potenzial zur genauen Analyse des DNA-Methylierungsstatus. Der Kern besteht darin, DNA durch enzymatische Reaktionen geschickt zu modifizieren, um Methylierungsinformationen in Signale umzuwandeln, die erkannt werden können von Hochdurchsatz-SequenzierungDieser Prozess verzichtet auf einige komplizierte chemische Behandlungsschritte, die in traditionellen Methoden zu DNA-Schäden führen können, verbessert erheblich die Genauigkeit und Zuverlässigkeit des Experiments und bietet Forschern eine neue Perspektive und Methode, um den Mechanismus der Methylierungsregulation in der Entwicklungsbiologie, Onkologie und Neurowissenschaft zu enthüllen.

DNA-ExtraktionJe nach Quelle der Probe wählen Sie die geeignete DNA-Extraktionsmethode aus. Blutproben können kommerzielle DNA-Extraktionskits für Blut verwenden; Gewebeproben müssen zuerst lysiert werden, und dann wird die DNA entweder durch Phenol-Chloroform-Extraktion oder durch Silikagel-Säulenadsorption extrahiert. Zelllinienproben können mit Zelllysemittel in Kombination mit Protease K verdaut werden, um DNA zu extrahieren. Die extrahierte DNA muss auf Reinheit und Konzentration getestet werden, um sicherzustellen, dass sie den experimentellen Anforderungen entspricht.

TET-EnzymoxidationEine angemessene Menge an DNA-Proben wird mit TET-Enzym und dem entsprechenden Puffer gemischt und im PCR-Gerät inkubiert. In der Regel beträgt die Reaktionsbedingung eine Inkubation bei 37 °C für 1-2 Stunden, damit das TET-Enzym 5mC zu 5hmC und anderen nachfolgend behandelbaren modifizierten Basen oxidieren kann. Dieser Schritt sorgt dafür, dass methylierte Cytosine sich in ihren chemischen Eigenschaften von unmethylierter Cytosine unterscheiden, was für die nachfolgende Differenzierung wichtig ist.

BisulfitbehandlungDie oxidierte DNA-Probe wird mit Bisulfid-Reagenz gemischt und bei einer bestimmten Temperatur und Zeit reagiert. In der Regel wird sie bei 50-60 °C für 12-16 Stunden inkubiert, um unmethylierte Cytosine in Uracil umzuwandeln, während methylierte Cytosine unverändert bleiben. Dieser Schritt ist der entscheidende Schritt, um methylierte und unmethylierte Cytosine durch die EM-seq-Technologie zu unterscheiden.

BibliotheksbauDie DNA-Bibliothek, die mit dem EM-seq-Enzym behandelt wurde, wurde durch eine PCR-Reaktion amplifiziert, um eine ausreichende Anzahl von Bibliotheksmolekülen für die anschließende Sequenzierung zu erhalten. Im Amplifikationsprozess wurden Primer entsprechend der Linker-Sequenz entworfen, um die effektive Amplifikation der Bibliotheksfragmente sicherzustellen.

Hochdurchsatz-SequenzierungDie konstruierte Bibliothek wurde auf der Plattform des Hochdurchsatzsequenzierens geladen und gemäß den Standardarbeitsanweisungen des Sequenziergeräts sequenziert. Während des Sequenzierungsprozesses sequenziert das Gerät jedes DNA-Fragment in der Bibliothek und erzeugt eine große Menge an ursprünglichen Sequenzierungsdaten, die normalerweise im FASTQ-Format gespeichert werden.

Enzymatischer Methyl-seq Wirkmechanismus und Arbeitsablauf (Vaisvila et al., 2021)

EM-seq Technologische Vorteile

Hohe GenauigkeitTraditionelles Bisulfit-Sequencing führt zu einer erheblichen Zersetzung der DNA, was zu Informationsverlust und einer Beeinträchtigung der Genauigkeit der Ergebnisse führt. EM-seq hingegen wandelt unmethylierte Cytosine präzise in Uracil um, während methylierte Cytosine erhalten bleiben, was die durch chemische Behandlungen verursachten Fehler erheblich reduziert und den Methylierungszustand der DNA genauer widerspiegeln kann.

Kleine ProbenanforderungEM-seq hat eine sehr geringe Nachfrage nach der ursprünglichen Probe, und es werden nur sehr kleine Mengen an DNA-Proben benötigt, um das Experiment durchzuführen. Für diese wertvollen klinischen Proben mit begrenzter Probenmenge, wie Biopsiegewebe und spurenweise embryonale Zellen, ist die EM-seq-Technologie zweifellos eine ideale Wahl, die effektiv das Dilemma vermeidet, dass eine Methylierungsanalyse aufgrund unzureichender Proben nicht durchgeführt werden kann.

Einfache OperationEM-seq ist einfacher im experimentellen Ablauf, während die Bisulfitbehandlungsschritte kompliziert sind, was eine langfristige Inkubation und mehrere Reinigungsschritte erfordert. Der Enzymumwandlungsprozess von EM-seq ist jedoch relativ einfach, und die Experimentierdauer wird erheblich verkürzt, was nicht nur die experimentelle Effizienz verbessert, sondern auch menschliche Fehler im Experimentationsprozess reduziert und die experimentellen Ergebnisse wiederholbarer macht.

Gute KompatibilitätEM-seq kann mit einer Vielzahl von nachgelagerten Sequenzierungsplattformen kombiniert werden und kann perfekt an gängige Sequenzierungsplattformen wie Illumina, PacBio und Nanopore angepasst werden. Dies bietet Forschern die Möglichkeit, Sequenzierungsmethoden flexibel entsprechend ihren eigenen experimentellen Bedürfnissen und den vorhandenen Gerätebedingungen auszuwählen und erweitert somit den Anwendungsbereich dieser Technologie.

EM-seq weist eine überlegene Uniformität der GC-Abdeckung auf (Vaisvila et al., 2021).

EM-seq Praktische Anwendung

Als innovative Sequenzierungsmethode hat die EM-Seq-Technologie mit ihrer einzigartigen enzymatischen Behandlungsstrategie die Grenzen traditioneller Technologien überwunden und zeigt großes Anwendungspotenzial in vielen Bereichen. Sie wird zunehmend zu einem leistungsstarken Werkzeug für Forscher, um die Geheimnisse des Lebens zu erkunden, medizinische Probleme zu überwinden und die Entwicklung verwandter Branchen wie der Landwirtschaft voranzutreiben.

Krankheitsfeld

KrebsforschungDie DNA-Methylierung spielt eine Schlüsselrolle bei dem Auftreten und der Entwicklung von Tumoren. Die EM-seq-Technologie kann Forschern helfen, abnormalen Methylierungsstellen, die mit Krebs in Verbindung stehen, genau zu identifizieren, und bietet somit eine solide Grundlage für die frühzeitige Diagnose, die Prognosebewertung und die Entwicklung neuer therapeutischer Ziele bei Krebs. Durch die vergleichende Analyse von DNA-Methylierungsmustern zwischen Tumorgeweben und normalen Geweben wird erwartet, dass einige spezifische Methylierungsmarker für das frühe Screening von Krebs gefunden werden.

Neurowissenschaftliche ForschungDie normale Funktion des Nervensystems hängt von einer präzisen Regulierung der Genexpression ab, und die DNA-Methylierung spielt dabei eine wichtige Rolle. Mit der EM-seq-Technologie können Forscher Methylierungsanomalien bei Erkrankungen des Nervensystems (wie Alzheimer, Parkinson usw.) untersuchen, die Krankheitsursachen dieser Erkrankungen erforschen und neue Wege zur Auffindung potenzieller Behandlungen eröffnen.

Entwicklungsbiologie

Forschung zur EmbryonalentwicklungIm Verlauf der Embryonalentwicklung kann die EM-Seq-Technologie verwendet werden, um die dynamischen Veränderungen der DNA-Methylierung von Zellen in verschiedenen Entwicklungsstadien zu verfolgen und die regulatorische Rolle der Methylierung im Prozess der Zellschicksalsbestimmung sowie der Gewebe- und Organbildung aufzudecken. Durch die Sequenzierung der Methylierung von frühen embryonalen Zellen können wir die Variation der Methylierung bei wichtigen Entwicklungsereignissen wie der Embryoimplantation und der Gastrulation verstehen, was wichtige Informationen für das Studium der molekularen Mechanismen der Embryonalentwicklung liefert.

Forschung zur Zell-DifferenzierungDiese Technologie kann die Methylierungsänderungen verschiedener Zelltypen während der Differenzierung analysieren und die Auswirkungen der Methylierung auf die zellspezifische Genexpression und die Aufrechterhaltung der Zellfunktion klären. Am Beispiel der Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen können die spezifischen Methylierungsstellen verschiedener hämatopoetischer Vorläuferzellen im Prozess der Differenzierung in verschiedene Blutzellen durch die EM-Seq-Technologie gefunden werden, um das Regulationsmechanismus der Differenzierung hämatopoetischer Zellen tiefgreifend zu verstehen.

Botanische Forschung

Forschung über Pflanzenwachstum und -entwicklungIm Prozess des Pflanzenwachstums und der -entwicklung, wie z.B. bei der Keimung von Samen, dem Wachstum von Sämlingen, der Blüte und der Fruchtbildung, kann die EM-Seq-Technologie verwendet werden, um die Regulation der DNA-Methylierung auf die Genexpression zu untersuchen und den Mechanismus der Methylierung in der Pflanzenmorphenese und der Organentwicklung aufzudecken.

Studie über die Stressresistenz von PflanzenDie DNA-Methylierung wird sich dynamisch ändern, wenn Pflanzen auf biologische Stressfaktoren (wie Schädlinge und Krankheiten) und abiotischen Stress (wie Trockenheit, Salinität und niedrige Temperaturen) reagieren. Die EM-Seq-Technologie kann verwendet werden, um diese Veränderungen zu analysieren, Methylierungsstellen und Gene, die mit der Stressresistenz in Zusammenhang stehen, zu identifizieren und theoretische Unterstützung für die Verbesserung von Pflanzenvarianten und die Steigerung der Stressresistenz von Nutzpflanzen zu bieten.

Verteilung der DMRs über das gesamte Genom (Gan et al., 2024)

EM-seq Herausforderungen und Lösungen

Als neue und potenzielle Technologie ist EM-seq in vielen Forschungsbereichen aufgetaucht, sieht sich jedoch auch einer Reihe von kniffligen Herausforderungen im praktischen Anwendungsprozess gegenüber. Diese Herausforderungen beeinträchtigen nicht nur die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der experimentellen Ergebnisse, sondern schränken auch die effiziente Anwendung dieser Technologie in einem breiteren Spektrum von Szenarien ein.

DNA-Extraktion und FragmentierungEs kann während des Extraktionsprozesses zu DNA-Verlust oder -Degradation kommen, was die nachfolgenden Experimente beeinträchtigen wird. Es ist schwierig, die Einheitlichkeit der Fragmentgröße während der Fragmentierung zu kontrollieren. Wenn das Fragment zu lang oder zu kurz ist, werden die Effizienz und Genauigkeit der Sequenzierung verringert. Verwenden Sie ein hochwertiges DNA-Extraktionskit und optimierte Extraktionsmethoden, wie die Auswahl eines für den Proben-Typ geeigneten Lysepuffers und die strikte Kontrolle von Parametern wie Temperatur und Zeit während der Extraktion. Im Fragmentierungsschritt können Methoden wie Enzymverdau oder Ultraschallzerkleinerung verwendet werden, und die besten Fragmentierungsbedingungen können durch experimentelle Optimierung bestimmt werden. Fragmente geeigneter Größe können durch Agarose-Gelelektrophorese ausgewählt werden.

BibliotheksbauDie geringe Effizienz beim Verbinden von Verbindern wird zu einer unzureichenden Ausbeute in der Bibliothek führen. Darüber hinaus kann während der PCR-Amplifikation eine Abweichung eingeführt werden, die dazu führt, dass einige Bereiche überamplifiziert oder unteramplifiziert werden, was die Genauigkeit und Abdeckung der Sequenzierungsergebnisse beeinträchtigt. Optimieren Sie die Reaktionsbedingungen der Verbindungsreaktion, indem Sie das Verhältnis von Linker zu DNA-Fragment, die Reaktionstemperatur und die Reaktionszeit anpassen. Verwenden Sie hochwertige Ligase, um die Ligationseffizienz zu verbessern. Im PCR-Amplifikationsprozess wurde das PCR-Amplifikationskit mit geringer Abweichung verwendet, um die PCR-Reaktionsbedingungen, wie die Annealing-Temperatur und die Zyklusanzahl, zu optimieren. Gleichzeitig kann der molekulare Barcode verwendet werden, um DNA-Fragmente zu kennzeichnen und die PCR-Amplifikationsabweichung zu korrigieren.

Datenvolumen und RechenressourcenEM-Seq erzeugt eine enorme Menge an Daten, die hohe Rechenressourcen erfordert, einschließlich Speicher, Speicherung und Rechengeschwindigkeit. Der Prozess der Datenverarbeitung und -analyse ist komplex und benötigt viel Zeit und Energie. Verwenden Sie einen Hochleistungsrechner oder eine Cloud-Computing-Plattform, um den Anforderungen der Datenverarbeitung und -analyse gerecht zu werden. Nutzen Sie Parallelverarbeitung, verteiltes Rechnen und andere Technologien, um die Berechnungseffizienz zu verbessern. Gleichzeitig optimieren Sie den Datenanalyseprozess und verwenden Sie effiziente Algorithmen und Softwaretools, um die Berechnungszeit und den Ressourcenverbrauch zu reduzieren.

StichprobenheterogenitätBiologische Proben weisen häufig eine Zellheterogenität auf, und der Methylierungsgrad ist in verschiedenen Zelltypen oder Zellzuständen unterschiedlich, was die genaue Analyse von Methylierungsmustern beeinflussen kann. Wenn das Forschungsobjekt ein spezifischer Zelltyp ist, können Zelltrennungstechniken wie Durchflusszytometrie und Laser-Capture-Mikrodissektion verwendet werden, um zunächst die Zielzellpopulation zu trennen und diese dann mittels EM-Seq zu analysieren. Die Einzelzell-EM-Seq-Technologie kann ebenfalls verwendet werden, um Methylierungsmuster direkt auf Einzelzellebene zu untersuchen, um die Heterogenität der Proben besser analysieren zu können.

Niedrig-DNA-Eingangs-EM-seq-Bibliotheken (Vaisvila et al., 2021)

Fazit

Zusammenfassend hat EM-Seq dank seiner einzigartigen Vorteile große Erfolge in der Biomedizin, Entwicklungsbiologie, Neurowissenschaft und Pflanzenforschung erzielt. Es bietet ein präzises Werkzeug zur Analyse von DNA-Methylierungsmustern und hilft, das Geheimnis von Krankheitsmechanismen und Entwicklungsprozessen zu enthüllen. Mit der kontinuierlichen Optimierung der Technologie wird sich auch die Anwendungsgrenze weiter ausdehnen, was voraussichtlich dazu führen wird, dass mehr Forschungsengpässe überwunden werden, Innovationen in allen Bereichen der Lebenswissenschaften hervorgebracht werden, in der zukünftigen wissenschaftlichen Forschungsreise heller strahlen und das menschliche Verständnis der Natur des Lebens auf eine neue Höhe bringen wird.

Referenzen:

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