ChIP-seq vs. ATAC-seq

Chromatinregulatorische Regionen spielen eine entscheidende Rolle in zahlreichen Krankheitsprozessen und der embryonalen Entwicklung. Um die genomische Regulierungslandschaft von Zellen und Geweben zu entschlüsseln, werden modernste epigenomische Sequenzierungstechnologien wie Chromatin-Immunopräzipitation-Sequenzierung (ChIP-seq) und die transposase-zugängliche Chromatin-Hochdurchsatz-Sequenzierung (ATAC-seq) sind entstanden. Diese Techniken ermöglichen es uns, spezifische Chromatinzustände und die damit verbundenen Transkriptionsfaktoren zu untersuchen, was wertvolle Einblicke in die zeitlichen und räumlichen Dimensionen der Genregulation bietet.

Die Einführung der Chromatin-Immunpräzipitation Chip (ChIP-chip) Technologie hat das Repertoire der Methoden zur epigenomischen Analyse weiter erweitert. Zu den bemerkenswerten Techniken gehören ChIP-seq, DNase I ultrasensitive Standortsequenzierung (DNase-seq) und ATAC-seqDiese leistungsstarken Ansätze ermöglichen es Forschern, die dynamischen Wechselwirkungen zwischen DNA und Proteinen umfassend zu untersuchen und Licht auf die komplexen regulatorischen Netzwerke zu werfen, die zelluläre Prozesse steuern und die Krankheitsverläufe beeinflussen.

ChIP-basierte Methoden

Fortschritte in Chip-basierten Forschungsmethoden haben einen leistungsfähigeren und verfeinerten Ansatz im Vergleich zu Mikroarrays hervorgebracht. ChIP-seq bietet mehrere wesentliche Vorteile, darunter hohe Auflösung, reduziertes Rauschen und umfassende Abdeckung. Da die Kosten für die Sequenzierung der zweiten Generation weiterhin schnell sinken, steht ChIP-seq kurz davor, ein unverzichtbares Werkzeug in der Erforschung der Genregulation und Epigenetik zu werden.

Im Gegensatz zu Mikroarrays bietet ChIP-seq eine umfassende und detaillierte Sicht auf DNA-Protein-Interaktionen, die es Forschern ermöglicht, Sequenzmotive besser zu charakterisieren und kritische Transkriptionsfaktoren, Enhancer und andere regulatorische Elemente zu identifizieren. Diese verbesserte Präzision und Sensitivität machen ChIP-seq zu einem unschätzbaren Werkzeug, um die Komplexität der genomischen Regulation zu entschlüsseln und die Mechanismen hinter verschiedenen biologischen Prozessen zu beleuchten.

Bitte beziehen Sie sich auf unseren Artikel. ChIP-Seq: Ein vielseitiges Werkzeug für die Epigenomik.

Methoden zur ChIP-seq-Analyse. (Nakato et al., 2021)

Traditionelles ChIP-Seq

Die traditionelle ChIP-seq-Technik, ein Grundpfeiler der Genomforschung, zielt darauf ab, DNA zu erfassen, die an spezifische Proteine gebunden ist. Dieser mehrstufige Prozess umfasst die Vernetzung von DNA und Proteinen in situ mit Formaldehyd, gefolgt von Sonikation, um kleine DNA-Fragmente von 200-600 Basenpaaren zu erzeugen. Anschließend wird eine Immunpräzipitation mit spezifischen Antikörpern durchgeführt, um DNA-Protein-Komplexe zu isolieren, die anschließend wieder entkreuzt werden. Die freigesetzte DNA durchläuft Schritte zur Bibliotheksvorbereitung, wie Endreparatur, Verknüpfung von Junctions und Sequenzierung.

Allerdings hat ChIP-seq bestimmte Einschränkungen. Die Verzerrung durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und die begrenzte Amplifikationslänge können Artefakte einführen. GC-Bias während der Lyse und Sequenzierung kann die Datenqualität beeinträchtigen. Darüber hinaus ist eine beträchtliche Anzahl von Zellen erforderlich (10⁵ ∼10⁷ Zellen) können während des Immunpräzipitationsprozesses zu erheblichen Verlusten führen. Darüber hinaus kann der Formaldehyd-Quervernetzungsprozess antigenische Epitopen von Transkriptionsfaktoren verdecken, was zu potenziellen falsch-positiven Ergebnissen führen kann. Ein alternativer Ansatz, bekannt als natürliche ChIP (N-ChIP), beseitigt das Problem des Maskierens von Epitopen und kann verwendet werden, wenn es sich um eine sehr kleine Anzahl von Zellen handelt.

ChIP-Technologie für Mikrozellen

Um die Einschränkung zu überwinden, eine große Anzahl von Zellen zu benötigen, haben Forscher die ChIP-Technologie für Mikrozellen untersucht. Verschiedene Methoden wurden entwickelt, um Experimente für niedrige Zellzahlen zu optimieren. Techniken wie chemisches Blotting in Kombination mit Chromatin-Immunpräzipitation und Tn5-Transposase zur Vorbereitung von Sequenzierungsbibliotheken haben es ermöglicht, Histon-ChIP-seq mit so wenigen wie 10.000 Zellen durchzuführen. Ultra-niedrig-input MNase-basierte natürliche CHIP (ULI-NChIP) hat hochwertige Histonmodifikationsprofile aus 10^3 bis 10^6 embryonalen Stammzellen erzeugt, dank Anpassungen im NChIP-Protokoll. Ein weiterer innovativer Ansatz, die mikrofluidische oszillatorische Wasch-basierte ChIP-seq (MOWChIP-seq), ermöglicht sogar eine genomweite Analyse von Histonmodifikationen mit nur 100 Zellen. Während diese Methoden relativ genaue Histonmodifikationsprofile in wenigen Zellen liefern können, ist ihre Wirksamkeit für viele Transkriptionsfaktoren aufgrund der Knappheit von Bindungsstellen im Genom begrenzt.

Einzelzell-ChIP-seq (scChIP-seq)

Betreten Sie das Reich der Einzelzell-ChIP-seq (scChIP-seq), das eine bahnbrechende Perspektive bietet. Im Gegensatz zu Bulk-ChIP-seq, das Chromatinmerkmale aus einer Zellpopulation erfasst, ermöglicht scChIP-seq Forschern, die genetische Vielfalt innerhalb heterogener Zellpopulationen zu untersuchen und die evolutionären Dynamiken von Tumorpopulationen zu verstehen. Die Tropfen-Einzelzell-ChIP-seq (Drop-ChIP) integriert ein mikrofluidisches Gerät mit Einzelzell-DNA und ermöglicht die Erstellung relativ niedriger Abdeckungs-Karten pro Zelle.

Empfohlene Lektüre: Die Vorteile und der Workflow von ChIP-seq.

ATAC-Seq

Die ATAC-seq-Technologie (Assay für transposase-zugängliche Chromatin-Sequenzierung) hat die transposase-offenen Chromatin-Assays revolutioniert und ermöglicht es Forschern, gleichzeitig offene Chromatinregionen, Nukleosomenlokalisierung und regulatorische Motive mit reduzierten Probenanforderungen (so niedrig wie 500~5000 Zellen) zu identifizieren. Durch die Nutzung von Motivinferenz haben Wissenschaftler erfolgreich die Bindungsstellen von DNA-bindenden Proteinen in B-Zell-Linien mithilfe von ATAC-seq deduziert.

Empfohlene Lektüre: ATAC-Seq – Eine Methode zur Untersuchung von offenem Chromatin.

Einzelzell-ATAC-Sequenzierungsanalyse. (Baek et al., 2020)

Ein entscheidender Vorteil von ATAC-seq ist das relativ einfache und effiziente "Zwei-Schritte"-Bibliotheksvorbereitungsverfahren: Transposition und PCR. In ATAC-seq-Experimenten werden Zellkerne isoliert und gesammelt, und die Chromatinstruktur im Kern wird mit Tn5-Transposase fragmentiert, die dann Sequenzierungsanschlüsse ligiert und den experimentellen Prozess erheblich vereinfacht. Die dicht gepackte Chromatin-DNA kann nicht in das Transposom eindringen, während die Chromatin-DNA in offenen Regionen zufällig eingefügt und vom Transposom fragmentiert wird. Die resultierende fragmentierte DNA wird für die anschließende Analyse gesammelt.

Die bemerkenswerteste Innovation von ATAC-seq liegt in der Verwendung von Tn5-Transposase. Zunächst zeigt Tn5-Transposase eine geringe Transpositionsaktivität, kann jedoch durch gezielte Modifikationen in eine hochaktive Form mit höherer Affinität zu DNA umgewandelt werden, was sie für die wissenschaftliche Forschung zugänglicher macht. Durch die In-vitro-Zusammenstellung von Tn5-Transposase mit entworfenen Artikulatoren können Forscher aktive Transposom-Komplexe bilden, die die Effizienz und Genauigkeit des Tests verbessern.

Es ist jedoch entscheidend anzuerkennen, dass die Tn5-Transposase aufgrund der sequenzabhängigen Bindung Bias einführt. Dennoch wurden computergestützte Werkzeuge entwickelt, um diesen Transpositionsbias zu korrigieren und die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der ATAC-seq-Daten zu gewährleisten.

Kombination von ChIP-seq und ATAC-seq

Bei der Vergleich mehrerer Proben ausschließlich auf... ChIP-Seq kann Herausforderungen bei der Identifizierung signifikanter regulatorischer Elemente darstellen. In solchen Fällen erweist sich ATAC-seq als wertvolle Ergänzung aufgrund seiner hohen Auflösung und seines Signal-Rausch-Verhältnisses, das die Identifizierung unterschiedlich regulierter Sequenzen, einschließlich Enhancer, ermöglicht. Die Integration von ChIP-seq mit ATAC-seq vereinfacht die Identifizierung unterschiedlicher Peaks und erhöht die analytische Leistungsfähigkeit.

Während Techniken wie DNase-seq und ATAC-seq genomische Merkmale ableiten können, können sie die Informationen, die durch ChIP-seq bereitgestellt werden, nicht vollständig ersetzen. All diese Methoden erkennen indirekt Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren an DNA, was eine weitere Validierung der abgeleiteten Aktionsstellen von Transkriptionsfaktoren basierend auf angereicherten Motiven erforderlich macht.

ChIP-seq identifiziert direkt spezifische DNA-Protein-Interaktionen, während ATAC-seq enthüllt die genomweite Chromatinöffnungsstruktur und bietet eine einzigartige Perspektive auf die chromatinregulatorische Landschaft. Durch die Kombination von ATAC-seq und ChIP-seq können Forscher ein umfassenderes und tieferes Verständnis der Dynamik der Chromatinregulation und ihrer biologischen Implikationen erreichen.

Es gibt jedoch potenzielle Einschränkungen bei der Verwendung von ATAC-seq in Isolation:

• Nicht alle Chromatinregulatoren besitzen entsprechende Motive; beispielsweise fehlen chromatinremodellierenden Proteinen spezifische DNA-Sequenzen. Die Wechselwirkungen zwischen diesen Proteinen und Nukleosomen sind entscheidend für die frühe embryonale Entwicklung und Zellschicksalsentscheidungen, und ihre Bindung kann nicht allein aus Informationen über offenes Chromatin abgeleitet werden.
• Bestimmte Motive können von mehreren sequenzspezifischen Transkriptionsfaktoren gebunden werden, was zu Mehrdeutigkeit bei der Identifizierung von Transkriptionsfaktoren führt.
• Einige homologe Transkriptionsfaktoren teilen sich ähnliche Motivmuster, was es schwierig macht, offenes Chromatin direkt einem bestimmten Transkriptionsfaktor zuzuordnen. In solchen Fällen bleibt die direkte Erkennung von Interaktionen zwischen spezifischen Transkriptionsfaktoren und DNA zuverlässiger.

Zusammenfassend bietet die kombinierte Nutzung von ChIP-seq und ATAC-seq einen leistungsstarken Ansatz, um tiefere Einblicke in die regulatorische Landschaft der Chromatin zu gewinnen. Während ATAC-seq ChIP-seq ergänzt, indem es eine breitere Perspektive auf die Chromatinöffnungen bietet, stellt ChIP-seq die direkte Identifizierung spezifischer DNA-Protein-Interaktionen sicher. Diese Integration hat das Potenzial, komplexe Dynamiken der Genregulation aufzudecken und die funktionale Bedeutung von Chromatinmodifikationen in verschiedenen biologischen Kontexten zu entschlüsseln.

Referenzen

1. Nakato, Ryuichiro und Toyonori Sakata. "Methoden zur ChIP-seq-Analyse: Ein praktischer Workflow und fortgeschrittene Anwendungen." Methoden 187 (2021): 44-53.
2. Baek, Seungbyn, und Insuk Lee. "Einzelzell-ATAC-Sequenzierungsanalyse: Von der Datenvorverarbeitung zur Hypothesenbildung." Zeitschrift für computergestützte und strukturelle Biotechnologie 18 (2020): 1429-1439.