ChIP-Seq: Ein vielseitiges Werkzeug für die Epigenomik

Was ist ChIP-Seq?

ChIP-seq ist eine der wichtigsten Techniken für die genomweite Profilierung von DNA-bindenden Proteinen, Histonmodifikationen oder Nukleosomen. Es bietet eine höhere Auflösung, weniger Rauschen und eine größere Abdeckung als ChIP-Chip. ChIP-seq kombiniert Next-Generation-Sequencing (NGS) mit Chromatin-Immunpräzipitation. ChIP-seq wurde als vielseitiges Werkzeug in der Epigenomik eingesetzt. Einerseits kann es Histonmodifikationen nachweisen; andererseits kann es die DNA-Protein-Interaktionen aufdecken. in vivoEs ist entscheidend für das Entschlüsseln von Genregulationsnetzwerken und ermöglicht ein umfassendes Verständnis der transkriptionalen Regulation.

Der Beitrag von ChIP-Seq zur Epigenom-Kartierung

1. Bindungsdiagramme von Transkriptionsfaktoren
Entschlüsseln Sie die genetischen Regulationsnetzwerke, die verschiedenen biologischen Prozessen zugrunde liegen.

2. Histonmodifikationskarten
Wie Methylierung, Trimethylierung, Acetylierung, usw..

3. Nukleosomkarten
Enthülle die Rolle von Nukleosomen in der transkriptionalen Regulation.

Wie funktioniert ChIP-Seq?

In einem ChIP-Experiment wird das DNA-bindende Protein kovalent an die DNA verknüpft. in vivo Durch Formaldehydbehandlung wird die Chromatinstruktur in Fragmente von 200-600 bp zerlegt. Die Verdauung mit Mikrokokken-Nuklease (MNase) ohne Quervernetzung wird häufig verwendet, um das Chromatin zu fragmentieren, da die MNase-Behandlung die Linker-DNA effizienter entfernt als die Sonikation. Allerdings zeigt der MNase-Verdau eine ausgeprägtere Sequenzbias. Ein spezifischer Antikörper gegen das interessierende Protein wird für die Immunpräzipitation verwendet. Die Qualität des Antikörpers ist sehr wichtig, um hochwertige ChIP- oder ChIP-seq-Daten zu generieren. Anschließend werden die Quervernetzungen rückgängig gemacht und die DNA für die NGS-Bibliotheksvorbereitung freigesetzt. Die immunpräzipitierte DNA wird zunächst einer Größenselektion unterzogen (gewöhnlich im Bereich von 150-300 bp). Schließlich werden ChIP-seq-Daten auf NGS-Plattformen wie Illumina-Plattformen generiert. Eine erhöhte Sequenzierungstiefe ermöglicht die Erkennung seltenerer Stellen.

Non-Histone ChIP-seq und Histon ChIP-Seq

ChIP-seq kann je nach verwendetem Antikörper im ChIP-Schritt in non-histone ChIP-seq und histone ChIP-seq unterteilt werden.

Bioinformatik-Pipeline für ChIP-Seq

Rohe Sequenzen müssen verarbeitet werden, um die ChIP-seq-Experimente zu interpretieren.

(i) Filtern von qualitativ schlechten Reads

Zuerst müssen minderwertige Reads und Kontaminanten entfernt sowie Adaptersequenzen beschnitten werden.

(ii) Reads an das Genom anpassen

Zweitens, ordnen Sie die Reads mit BWA, Bowtie, GSNAP oder der Wikipedia-Liste der Alignertools dem Genom zu.

(iii) Filterartefakte und Reads, die an mehreren Stellen ausgerichtet sind

Drittens, filtern Sie Artefakte, die im PCR-Amplifikationsschritt erstellt wurden, sowie Reads, die an mehreren Stellen ausgerichtet sind.

(iv) Spitzenaufruf

Werkzeuge wie MACS, PeakSeq und ZINBA können genomische Regionen mit Signalverstärkung identifizieren, wie z.B. ein gebundenes Protein, Histonmodifikation oder offene Chromatin. Differenzielle Peak-Bestimmung kann unter Verwendung von edgeR, DESeq, baySeq oder SAMSeq durchgeführt werden.