Was ist ChIP-seq?
ChIP-Sequenzierung (auch bekannt als ChIP-seq), das Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)-Assays mit DNA-Sequenzierungist eine leistungsstarke Technik zur genomweiten Profilierung von DNA-bindenden Proteinen, Histonmodifikationen oder Nukleosomen. ChIP ist eine Art von Immunpräzipitation (IP), die verwendet wird, um spezifische DNA-Stellen zu isolieren, die in direkter physikalischer Wechselwirkung mit Transkriptionsfaktoren und anderen Proteinen stehen. Bei ChIP werden spezifische Antikörper verwendet, um DNA-Fragmente anzureichern, die an bestimmte Proteine oder Nukleosomen gebunden sind.
ChIP-Seq war eine der frühen Anwendungen von NGS (Next-Generation-Sequenzierung)und die erste Studie zur großflächigen Profilierung der genomweiten Histonmethylierungen unter Verwendung von ChIP-Seq wurde 2007 veröffentlicht (Barski et al., 2007). Die Sequenzierung dieser Studie wurde auf der Plattform des Solexa 1G Genomanalysators durchgeführt. Im selben Jahr verwendeten Johnson et al. (2007) ChIP-seq um die genomweite Kartierung von Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren zu erzeugen. Robertson et al. (2007) entwickelten ChIP-seq um mammalianische DNA-Sequenzen zu identifizieren, die in vivo von Transkriptionsfaktoren gebunden sind. Diese beiden Arbeiten zeigten auch die erhöhte Sensitivität und Spezifität von ChIP-seqAufgrund des raschen Fortschritts von NGS-Technologie und die sinkenden Kosten für das Sequenzieren, ChIP-seq ist zu einem unverzichtbaren Werkzeug für die Charakterisierung von Epigenomen und die Untersuchung der Genregulation geworden (Park, 2009).
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Unterschied zwischen ChIP-Chip und ChIP-Seq
ChIP-Chip, ChIP in Verbindung mit Mikroarrays, und ChIP-seq sind zwei Standardtechniken zur Identifizierung der genomweiten DNA-Protein-Bindungsinteraktionen. Durch die Nutzung von Sequenzierungstechnologien, ChIP-seq bietet viele Vorteile gegenüber ChIP-Chip, wie in Tabelle 1 zusammengefasst (Park, 2009; Schones und Zhao, 2008).
Tabelle 1. Vergleich von ChIP-chip und ChIP-seq.
|
ChIP-Chip |
ChIP-seq |
| Maximale Auflösung |
Array-spezifisch, allgemein 30-100 bp |
Einzelne Nukleotid |
| Abdeckung |
Begrenzt durch Sequenzen im Array; sich wiederholende Regionen werden normalerweise ausgeblendet. |
Begrenzt nur durch die Ausrichtbarkeit der Reads auf das Genom; nimmt mit der Leselänge zu; viele repetitive Regionen können abgedeckt werden. |
| Flexibilität |
Abhängig von den verfügbaren Produkten; mehrere Arrays können für große Genome erforderlich sein. |
Genomweite Analyse eines sequenzierten Organismus |
| Quelle des Plattformgeräuschs |
Kreuzhybridisierung zwischen Sonden und unspezifischen Zielen |
Es kann eine gewisse GC-Bias vorhanden sein. |
| Experimentelles Design |
Einzel- oder Doppelkanal, je nach Plattform |
Einzelkanal |
| Kosteneffiziente Hüllen |
Profiling ausgewählter Regionen; wenn ein großer Teil des Genoms für die Modifikation oder das Protein von Interesse angereichert ist (breite Bindung) |
Große Genome; wenn ein kleiner Teil des Genoms für die Modifikation oder das Protein von Interesse angereichert ist (scharfe Bindung) |
| Erforderliche Menge an ChIP-DNA |
Hoch (einige Mikrogramm) |
Niedrig (10-50 ng) |
| Dynamikbereich |
Unterer Nachweisgrenze; Sättigung bei hohem Signal |
Nicht begrenzt |
| Verstärkung |
Mehr erforderlich |
Weniger erforderlich; Einzelmolekül-Sequenzierung ohne Amplifikation ist verfügbar. |
| Multiplexing |
Nicht möglich |
Möglich |
Wie funktioniert ChIP-seq?
Der Arbeitsablauf von ChIP-seq verwendet, um die spezifischen DNA-Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren, DNA-bindende Enzyme oder andere DNA-assoziierte Proteine (nicht-Histon ChIP) zu profilieren, und DNA-Stellen, die modifizierten Nucleosomen entsprechen (Histon ChIP), wie in Abbildung 1 dargestellt (Park, 2009). Nach den ChIP-Protokollen wird die Chromatinfragmentierung durchgeführt und die quervernetzten Proteine oder modifizierten Nucleosomen mit einem spezifischen Antikörper gegen das Protein oder die Histonmodifikation immunpräzipitiert. Nach der DNA-Reinigung und dem Bibliotheksaufbau können DNA-Fragmente gleichzeitig auf einer der Sequenzierungsplattformen sequenziert werden, wie z. B. dem Illumina Solexa Genome Analyzer, Roche 454 und Applied Biosystems (ABI) SOLiD-Plattformen sowie HeliScope von Helicos, wie in Abbildung 1 dargestellt. Mit dem enormen Fortschritt der NGS-TechnologieDie Illumina-Plattform, wie Hiseq, ist die am häufigsten verwendete Plattform für das Sequenzieren.
Abbildung 1. Übersicht über ein ChIP-seq-Experiment (Park, 2009).
Experimentelles Design von ChIP-seq
Die Enzyklopädie der DNA-Elemente (ENCODE) und die Konsortien der Modellorganismen ENCODE (modENCODE) haben eine Reihe von Arbeitsstandards und Richtlinien entwickelt für ChIP-seq Experimente basierend auf den Erfahrungen von Hunderten von ChIP-seq Experimente (Landt et al., 2012). Um hochwertige ChIP-seq-Daten zu erhalten, sollten mehrere technische Aspekte berücksichtigt werden in der ChIP-seq experimentelles Design, einschließlich Antikörper, Zellzahl, Kontrollen, Replikate, Chromatinfragmentierung, Bibliothekskonstruktion und Sequenzierung (Kidder et al., 2011).
Antikörper
Die Qualität der für ChIP verwendeten Antikörper ist einer der wichtigsten Faktoren, die zur Qualität von ChIP-Seq Daten.
Ein empfindlicher und spezifischer Antikörper wird ein hohes Maß an Anreicherung bieten. Die begrenzte Effizienz des Antikörpers ist der Hauptgrund für das Scheitern. ChIP-seq Experimente.
Die Validierung und Charakterisierung von Antikörpern sollte vor Beginn der ChIP durchgeführt werden.
Handynummer
Da das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) direkt mit der Zellzahl korreliert ist, kann die Verwendung der richtigen Zellanzahl dazu beitragen, das Hintergrundrauschen zu verringern.
Die Menge des zu untersuchenden Proteins oder der Histonmodifikation sowie die Qualität des Antikörpers sollten bei der Bestimmung der Zellanzahl berücksichtigt werden.
Steuerungen
Ein wichtiger Teil von ChIP-seq Experimentelles Design besteht darin, zu bestimmen, welche Kontrollen verwendet werden sollen. Ein ChIP-seq Der Gipfel sollte mit der gleichen Region in einer passenden Kontrollgruppe verglichen werden.
Es gibt mehrere verschiedene Steuerungstypen, aber keinen Konsens darüber, welcher am geeignetsten ist:
Eingabe-DNA.
Mock-IP: DNA, das aus IP ohne Antikörper gewonnen wurde.
Nonspezifische IP: Verwendung eines Antikörpers gegen ein Protein, von dem nicht bekannt ist, dass es an der DNA-Bindung beteiligt ist.
Replikate
Hochwertig ChIP-seq Datensätze sind wertvolle Ressourcen für die Gemeinschaft. Viele Faktoren, einschließlich Zellkulturbedingungen, ChIP und Bibliothekskonstruktion, können zur Variabilität zwischen Datensätzen beitragen.
Um die Zuverlässigkeit der Daten zu gewährleisten, sind biologische Replikatexperimente erforderlich.
Chromatinfragmentierung
Vor ChIP muss das Chromatin in eine handhabbare Größe fragmentiert werden.
ChIP-Seq Für DNA-bindende Proteine werden Endonuklease-Digestion oder Sonikation verwendet, um DNA zu fragmentieren.
ChIP-seq Für Histonmodifikationen wird die Mikrokokken-Nuklease (MNase) Verdau verwendet, um DNA zu fragmentieren.
Bibliothekskonstruktion und Sequenzierung
Bibliotheken können aus ChIP-DNA gemäß den standardisierten Protokollen des Sequenzierungsplattform erstellt werden.
Der Prozess der Bibliothekskonstruktion und Sequenzierung, einschließlich der Größenwahl, Gelreinigung, PCR, Einzel- oder Paarend-Sequenzierungsstrategie und Sequierungstiefe, würde die ChIP-seq Datenqualität.
Unter Berücksichtigung der oben genannten technischen Aspekte, ein ChIP-seq ein Hochdurchsatz-Sequenzierer. Die experimentelle Gestaltung, die qualitativ hochwertige Daten liefern würde, wird in Abbildung 2 (Kidder et al., 2011) veranschaulicht. Zunächst sollten die geeigneten Kontrollen für die Antikörperspezifität vor der ChIP-Analyse bestimmt werden. Chromatin wird nach der Isolierung der idealen Zellanzahl durch Sonikation oder enzymatische Methoden auf eine ideale Größenordnung zerkleinert. Anschließend werden hochwertige Antikörper für die ChIP-Analyse verwendet. Nach der Reinigung der ChIP-angereicherten DNA wird eine Bibliothek erstellt, um Sequenzierungen auf einem Hochdurchsatz-Sequenzierer zu ermöglichen. NGS Plattformen.
Abbildung 2. ChIP-seq Versuchsdesign (Kidder et al., 2011).
Bei CD Genomics bieten wir Ihnen hochwertige Sequenzierung und integrierte Bioinformatik Analyse für Ihre ChIP-Seq Projekt zur genauen Erfassung und Bestimmung der Proteinbindungsstellen im gesamten Genom. Wenn Sie zusätzliche Anforderungen oder Fragen haben, zögern Sie bitte nicht, uns zu kontaktieren.
Zusätzliche Lektüre:
Pipeline und Werkzeuge für die ChIP-seq-Analyse
Referenzen:
- Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T.Y., Schones, D.E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I. und Zhao, K. (2007). Hochauflösende Profilierung von Histonmethylierungen im menschlichen Genom. Zelle 129, 823-837.
- Johnson, D.S., Mortazavi, A., Myers, R.M. und Wold, B. (2007). Genomweite Kartierung von in vivo Protein-DNA-Interaktionen. Wissenschaft 316, 1497-1502.
- Kidder, B.L., Hu, G. und Zhao, K. (2011). ChIP-Seq: technische Überlegungen zur Gewinnung hochwertiger Daten. Natur Immunologie 12, 918-922.
- Landt, S.G., Marinov, G.K., Kundaje, A., Kheradpour, P., Pauli, F., Batzoglou, S., Bernstein, B.E., Bickel, P., Brown, J.B., Cayting, P., et al. (2012). ChIP-seq-Richtlinien und -Praktiken der ENCODE- und modENCODE-Konsortien. Genomforschung 22, 1813-1831.
- Park, P.J. (2009). ChIP-seq: Vorteile und Herausforderungen einer reifenden Technologie. Naturwissenschaftliche Rezensionen Genetik 10, 669-680.
- Robertson, G., Hirst, M., Bainbridge, M., Bilenky, M., Zhao, Y., Zeng, T., Euskirchen, G., Bernier, B., Varhol, R., Delaney, A., et al. (2007). Genomweite Profile der STAT1-DNA-Assoziation mittels Chromatin-Immunpräzipitation und massiv paralleler Sequenzierung. Naturmethoden 4, 651-657.
- Schones, D.E., und Zhao, K. (2008). Genomweite Ansätze zur Untersuchung von Chromatinmodifikationen. Naturwissenschaften Reviews Genetik 9, 179-191.
Richtlinien zur Einreichung von Proben
