Pipeline und Werkzeuge für die ChIP-Seq-Analyse

Was ist Chip-Seq-Analyse?

Chromatin-Immunopräzipitation-SequenzierungChIP-seq) Analyse dient als eine unverzichtbare Technik in der epigenomischen Forschung. Diese Methode verwendet Antikörper, die spezifische DNA-bindende Proteine oder Histonmodifikationen anvisieren, um Regionen der Anreicherung im Genom zu identifizieren. Die Nutzung von Histonmodifikationen in der ChIP-seq-Analyse ermöglicht eine tiefgehende Untersuchung epigenetischer Merkmale und ihrer biologischen Funktionen. Mit den Fortschritten in Nächste Generation Sequenzierung Durch (NGS) Technologien und computergestützte Analysen hat sich unser Verständnis der epigenomischen Landschaft erheblich erweitert, was uns darüber informiert, wie sie zur zellulären Identität, Entwicklung, Linienbestimmung und der Ätiologie eines breiten Spektrums von Erkrankungen, einschließlich Krebs und anderer Krankheiten, beitragen kann.

Vorteile von ChIP-Seq 

• Der ChIP-seq Technologie besitzt die Fähigkeit, auf Nukleotid-Ebene zu differenzieren und bietet äußerst detaillierte Informationen zu Chromatin-Bindungsstellen über gesamte Genome hinweg, wodurch die Komplexität der Protein-DNA-Interaktionen beleuchtet wird. Dies ermöglicht es uns, mit höherer Genauigkeit Proteinbindungsstellen zu identifizieren, wie zum Beispiel die für Transkriptionsfaktoren und Histonmodifikationsenzyme.
• Im Gegensatz zu ChIP-chip gibt es keine Geräusche, die durch die Hybridisierung von DNA-Fragmenten entstehen, bei denen GC-Gehalt, Fragmentlänge, Konzentration und strukturelle Variationen die Hybridisierung beeinträchtigen könnten.
• ChIP-seq ermöglicht eine genomweite Analyse, die über die lokale Bereichsanalyse hinausgeht. Dieser breitere Ansatz ermöglicht ein umfassendes Verständnis der Bindungsmuster eines bestimmten Proteins auf genomischer Ebene, einschließlich der Identifizierung und Regulierung von Zielgenen.
• Quantitative Chromatin-Bindungs-Signale, die durch ChIP-seq-Daten bereitgestellt werden, spiegeln die Häufigkeit und Bindungsintensität von Proteinen in verschiedenen genomischen Regionen wider. Diese quantitative Analyse erleichtert den Vergleich von Chromatin-Bindungsmustern unter unterschiedlichen Bedingungen und ermöglicht die Identifizierung differenzieller Bindungsstellen.
• Die Hochdurchsatz-Sequenzierungseigenschaft von ChIP-seq ermöglicht die gleichzeitige Verarbeitung einer großen Anzahl von Proben und Daten, wodurch die experimentelle Effizienz verbessert wird. Darüber hinaus ermöglicht seine hohe Empfindlichkeit die Erkennung von Proteinbindungsstellen mit geringer Häufigkeit und deckt potenziell kritische regulatorische Regionen auf.
• Die ChIP-seq-Technologie, unabhängig von vorherigen Annahmen oder Primerdesign, weist minimale experimentelle Verzerrungen und systematische Fehler auf, was zu Daten führt, die objektiver und zuverlässiger sind.
• ChIP-seq Daten können auch mit anderen Omics-Daten integriert werden (wie zum Beispiel RNA-Seq, ATAC-seq usw.) für eine umfassende Analyse, um die Komplexität der regulatorischen Netzwerke der Genexpression vollständig zu verstehen. Diese integrative Analyse trägt dazu bei, die mehrstufigen Interaktionen zwischen Chromatinstruktur und Genregulation zu erhellen.

Die Herausforderungen von Chip-Seq

ChIP-seq ist eine leistungsstarke Methode zur Identifizierung genomweiter DNA-Bindungsstellen für ein Protein von Interesse. Die Kartierung der chromosomalen Standorte von Transkriptionsfaktoren (TFs), Nukleosomen, Histonmodifikationen, Chromatinumbauenzymen, Chaperonen und Polymerasen ist eine der zentralen Aufgaben der modernen Biologie. Zu diesem Zweck ist ChIP-seq die Standardmethodologie (Bailey et al., 2013). Mehrere Herausforderungen, die bei ChIP-seq auftreten, liegen nicht nur in der Probenvorbereitung und Sequenzierung, sondern auch in der computergestützten Analyse.

Im Gegensatz zu anderen Arten von massiv parallelen Sequenzierungsdaten, die ChIP-seq Daten haben mehrere Eigenschaften:

• Histonmodifikationen decken größere Bereiche der DNA ab als Transkriptionsfaktoren.
• Reads werden auf eine kleinere Anzahl von Basen gekürzt.
• Fragmente sind im Vergleich zu Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren ziemlich groß.
• Messungen von Histonmodifikationen schwanken häufig entlang gut positionierter Nukleosomen.

Um aussagekräftige Daten aus den Rohsequenzdaten zu extrahieren, muss die ChIP-seq Datenanalyse sollte:

• Identifizieren Sie genomische Regionen - 'Spitzen' - in denen TF bindet oder Histone modifiziert sind.
• Quantifizieren und vergleichen Sie die Bindungs- oder Histonmodifikationsniveaus zwischen den Proben.
• Charakterisieren Sie die Beziehungen zwischen dem Chromatinzustand und der Genexpression oder dem Spleißen.

Chip-Seq Bioinformatikanalyse-Workflow

Die Bioinformatikanalyse-Workflow für ChIP-seq-Daten und die Überlegungen zu jedem Schritt sind in Abbildung 1 (Nakato und Shirahige, 2017) dargestellt. Das Verfahren zur Probenvorbereitung, Sequenzierung und Kartierung (Abbildung 1A) ist in beiden Experimenten mit einzelnen oder wenigen Proben (Abbildung 1B) und Experimenten mit vielen Proben (Abbildung 1C) üblich. Zunächst werden die Sequenzierungsreads von ChIP-seq werden analysiert, um die Qualität der Reads zu bewerten. Nach den Qualitätsmetriken werden die Reads auf das Referenzgenom abgebildet. Im Vergleich zu den Eingangs-Reads werden genomische Regionen, die signifikant für ChIP-Reads angereichert sind, als Peaks identifiziert. Andere genomische Regionen werden als unspezifischer Hintergrund betrachtet. Die Read-Dichten können entlang des Genoms visualisiert werden. Die Anpassung der Peak-Erkennungsstrategie und -parameter an die Eigenschaften jeder Probe ist in der Probenanalyse möglich (Abbildung 1B). Aber eine Einzelanpassung ist bei der Analyse im großen Maßstab schwierig (Abbildung 1C), bei der objektive Qualitätsmetriken für eine multilaterale quantitative Bewertung notwendig sind, um Daten von schlechter Qualität automatisch herauszufiltern. Die identifizierten Peaks stellen Kandidaten für Histonmodifikationen und gezielte Protein- oder DNA-Bindungsstellen dar, die verwendet werden können, um assoziierte funktionale Annotationen zu identifizieren, wie z.B. Bindungsmotive.

Abbildung 1. ChIP-seq Analyse-Workflow. Angepasst von (Nakato und Shirahige, 2017)

Bei der Durchführung ChIP-Seq Bei der Analyse von (Chromatin-Immunpräzipitations-Sequenzierungs-)Daten sind die allgemein beobachteten Prozesse: Verarbeitung der Rohdaten, Qualitätskontrollanalyse, Zuordnung der Reads, Bewertung der Ausrichtungsqualität der Reads, Peak-Calling, Annotation und Analyse, neben anderen grundlegenden Schritten.

Qualitätskontrolle: Ziel des Schrittes der Qualitätskontrolle (QC) ist es, die substantielle Qualität der aus der Sequenzierung gewonnenen Hochdurchsatzdaten zu bewerten. Dazu gehört die Überprüfung der Qualität der Rohsequenzierungsdaten, wie z.B. die Längenverteilung der Sequenzierungsreads und die Sequenzierungsfehlerquote. Das am häufigsten verwendete Werkzeug für eine solche Analyse ist FastQC. Darüber hinaus können, falls Sequenzen von geringer Qualität identifiziert werden, diese in nachfolgenden Trimmphasen verworfen werden.

Lesekarte: Der Zweck der Read-Mapping besteht darin, getrimmte Sequenzierungsreads mit dem Referenzgenom auszurichten. Dies zielt darauf ab, die genaue genomische Position jedes Reads zu bestimmen. Mapping-Tools wie Bowtie, Bowtie2 oder BWA werden typischerweise für das Mapping von Sequenzierungsreads verwendet, wobei die Eingaben im FASTQ- oder CSFSATQ-Format vorliegen. Sowohl Bowtie2 als auch BWA berücksichtigen Indels (Insertionen und Deletionen) durch Gap-Ausrichtung, was sie für lange und/oder gepaarte Reads geeignet macht.

Gipfelaufruf: Der Schritt der Spitzenidentifikation konzentriert sich auf die Erkennung der Bereiche mit reichhaltiger Protein-DNA-Interaktion im gesamten Genom. MACS2 ist ein häufig verwendetes Werkzeug in der Analyse von ChIP-Seq-Daten, das sehr effektiv darin ist, verstärkte Bereiche zu unterscheiden. ChIP-Seq Daten, aufgrund ihrer Einbeziehung von genomischen Informationen und statistischen Modellen. Die kürzliche Entwicklung mehrerer Peak-Calling-Tools erweitert jedoch das Repertoire der verfügbaren Methoden. Zum Beispiel ist SICER eine weitere Anwendung, die entwickelt wurde, um angereicherte Regionen in ChIP-Seq Daten. Durch die Berücksichtigung nicht nur der Prominenz der Peaks, sondern auch ihres räumlichen Verteilungsmusters könnte SICER unter bestimmten Umständen akzeptablere Ergebnisse im Vergleich zu MACS2 liefern. Bestimmte Artikel haben vorgeschlagen, dass die Verwendung unterschiedlicher Eingangs-DNA-Bibliotheken als Hintergrundkontrollen einen erheblichen Einfluss auf die Peak-Erkennung haben kann. Im Allgemeinen werden bei der Verwendung einer INPUT-seq-Bibliothek mit größerer Sequenzierungstiefe zur Normalisierung eine größere Anzahl von Peaks als statistisch signifikant identifiziert, trotz der Unterschiede in der Größenordnung der Abweichungen zwischen verschiedenen ChIP-Datensätzen. 

Abbildung 2. Effekt der Normalisierung mit verschiedenen INPUT-seq auf die ChIP-seq Peak-Bestimmung. (Ho et al., 2011)

Spitzenannotation: Die funktionale Annotation der identifizierten angereicherten Regionen wird durchgeführt, einschließlich der funktionalen Klassifizierung von Zielgenen, regulatorischen Elementen usw. Die hauptsächlich für diesen Zweck verwendeten Werkzeuge sind ChIPseeker und Homer.

Differentialanalyse: Verschiedene Bedingungen von ChIP-Seq Daten werden verglichen, um Unterschiede in angereicherten Regionen zu identifizieren, um Transkriptionsfaktor-Zielgene oder Veränderungen in der Chromatinstruktur zu identifizieren. Zu den wichtigsten verwendeten Werkzeugen gehören DESeq2, edgeR und so weiter.

Gene-Set-Anreicherungsanalyse: Werkzeuge wie GOseq und ChIP-Enrich werden verwendet, um die Assoziation zwischen angereicherten Regionen und spezifischen Gen-Sets für die funktionale Annotation und biologische Interpretation zu analysieren.

Ergebnisinterpretation und -visualisierung: Die biologische Interpretation der Ergebnisse der differentiellen Analyse und der angereicherten Regionen wird durchgeführt, wobei die Konsistenz mit den Forschungshypothesen überprüft wird. Schließlich werden mit Tools wie IGV (Integrative Genomics Viewer), R-Paketen (ggplot2, heatmap usw.) die Ergebnisse aus ChIP-Seq Daten werden visualisiert, wobei angereicherte Regionen, Genannotation und Ergebnisse der differentiellen Analyse dargestellt werden.

Chip-Seq-Datenanalysetools

Es gab große Anstrengungen, die analytischen Werkzeuge zu verbessern, die in der Analyse von ChIP-seq Daten, und jeder Schritt hat zur Entwicklung spezialisierter Softwaretools geführt. Eine Auswahl von Softwaretools, die für Mapping und Peak-Calling verfügbar sind, ist kurz in Tabelle 1 aufgeführt (Furey, 2012).

Tabelle 1. Eine Auswahl von Software-Tools, die für das Mapping und die Peak-Erkennung bei der Analyse von ChIP-seq-Daten verfügbar sind.

Neben der Erkennung von angereicherten oder gebundenen Regionen in ChIP-seq Datenanalyse, eine wichtige Frage ist, Unterschiede zwischen Bedingungen zu bestimmen. Aufgrund der Komplexität von ChIP-seq-Daten in Bezug auf Rausch und Variabilität ist die Frage insbesondere für ChIP-seq besonders herausfordernd. In den letzten Jahren wurden viele verschiedene computergestützte Werkzeuge entwickelt und veröffentlicht, um Differenzen zu analysieren. ChIP-seq Analyse. Diese Werkzeuge zeigen wichtige Unterschiede in ihren algorithmischen Einstellungen, in der Anzahl und Größe der erkannten differentiellen Regionen (DR) und im Anwendungsbereich. Eine Beschreibung von 14 verschiedenen Werkzeugen zur Analyse von differentiellen ChIP-seq-Daten ist in Tabelle 2 aufgeführt (Steinhauser et al., 2016).

Tabelle 2. Beschreibung verschiedener Werkzeuge zur Analyse von differentiellen ChIP-seq-Daten.

Der Entscheidungsbaum, der die richtige Werkzeugwahl anzeigt, ist in Abbildung 3 dargestellt. Die Wahl des Werkzeugs hängt von mehreren Faktoren ab: der Form des Signals (scharfe Spitzen oder breite ChIP-Anreicherungen), der Anwesenheit von Replikaten und der Anwesenheit eines externen Satzes von Regionen von Interesse. Die in Schwarz angegebenen Werkzeuge liefern mit den Standardeinstellungen gute Ergebnisse, während die in Grau angegebenen Werkzeuge eine umfassendere Feinabstimmung der Parameter erfordern, um optimale Ergebnisse zu erzielen.

Abbildung 3. Entscheidungsbaum zur Auswahl des geeigneten Werkzeugs. Adaptierte von (Steinhauser et al., 2016).

Technische Richtlinien zur Analyse von Chip-Seq-Daten

Jüngste Fortschritte in der Sequenzierungstechnologie und -analyse ermöglichen es uns, Hunderte von ChIP-Proben gleichzeitig zu bearbeiten. Es gibt jedoch weiterhin einige Probleme bei der Analyse von ChIP-seq Daten, wie die falsch positiven Peaks, die mehrfach gemappten Reads und die schlechte Überlappung zwischen den Ergebnissen der Peak-Findungsalgorithmen. Um hochwertige Ergebnisse aus der computergestützten Analyse von ChIP-seq Daten, einige technische Aspekte sollten berücksichtigt werden, die unten aufgeführt sind (Bailey et al., 2013):

1) Sequenzierungstiefe

Effektive Analyse von ChIP-seq Daten erfordern eine ausreichende Abdeckung durch Sequenzlesungen (Sequenzierungstiefe). Die erforderliche Sequenzierungstiefe hängt hauptsächlich von der Größe des Genoms sowie der Anzahl und Größe der Bindungsstellen des Proteins ab.

20 Millionen Reads könnten für mammalische TFs und Chromatinmodifikationen ausreichend sein, die typischerweise an spezifischen, engen Stellen lokalisiert sind, wie z.B. enhancer-assoziierten Histonmarkierungen (Landt et al., 2012).

Proteine mit breiteren Faktoren, einschließlich der meisten Histonmarkierungen, oder mehr Bindungsstellen, wie RNA Pol II, benötigen bis zu 60 Millionen Reads für Säugetiere. ChIP-seq (Chen et al., 2012).

Kontrollproben sollten deutlich tiefer sequenziert werden als die ChIP-Proben.

2) Lese-Mapping und Qualitätsmetriken

Vor der Zuordnung zum Referenzgenom sollten die Reads durch Anwendung eines Qualitätsgrenzwerts gefiltert werden.

Es ist wichtig, den Prozentsatz der eindeutig zugeordneten Reads zu berücksichtigen, der von den Mapping-Tools gemeldet wird.

3) Spitzenaufruf

Die Analyse von ChIP-seq-Daten besteht darin, die Regionen des Genoms vorherzusagen, in denen das ChIP-ed Protein gebunden ist, indem Regionen mit Peaks gefunden werden.

Ein feiner Ausgleich zwischen Sensitivität und Spezifität hängt von der Wahl eines geeigneten Peak-Calling-Algorithmus und einer Normalisierungsmethode ab, die auf dem Typ des ChIP-ed Proteins basieren.

4) Bewertung der Reproduzierbarkeit

Um die Reproduzierbarkeit der experimentellen Ergebnisse sicherzustellen, sind mindestens zwei biologische Replikate von jedem erforderlich. ChIP-seq Experimente werden empfohlen, durchgeführt zu werden.

Die Reproduzierbarkeit sowohl der Reads als auch der identifizierten Peaks sollte untersucht werden.

5) Differenzielle Bindungsanalyse

Vergleichend ChIP-seq Die Analyse einer zunehmenden Anzahl von proteinbindenden Regionen über verschiedene Bedingungen oder Gewebe wird mit dem stetigen Anstieg von NGS (Next-Generation-Sequencing)-Projekten erwartet.

Die direkte Berechnung von differential gebundenen Regionen zwischen Behandlungsproben ohne Kontrollen wird nicht empfohlen.

6) Spitzenannotation

Das Ziel der Annotation ist es, die ChIP-seq Spitzen mit funktionell relevanten genomischen Regionen, wie z.B. Genpromotoren, Transkriptionsstartstellen, intergenen Regionen usw.

7) Motivanalyse

Die Motivanalyse ist nützlich für weit mehr als nur die Identifizierung des ursächlichen DNA-bindenden Motivs in TF ChIP-seq-Spitzen.

Wenn das Motiv des ChIP-ed Proteins bereits bekannt ist, bietet die Motivanalyse eine Bestätigung für den Erfolg des Experiments.

Anwendung der ChiP-Seq-Datenanalyse

ChIP-Seq ist eine Technik, die in der biologischen Forschung weit verbreitet ist. Sie untersucht die Wechselwirkungen zwischen Proteinen und DNA auf Chromatin und beleuchtet damit die Mechanismen der Genregulation, Epigenetik und Prozesse, die an der Krankheitsprogression und -entwicklung beteiligt sind. Epigenetische Ungleichgewichte im Krankheits- im Vergleich zu gesunden Zuständen könnten Veränderungen in Histonmodifikationen und Transkriptionsfaktoren umfassen. An diesem Punkt, ChIP-Seq Forschung wurde betrieben, um die molekularen Pathologien von Krebs und anderen Krankheiten zu klären. Sie hat auch potenzielle Implikationen für die Ableitung neuer Ziele zur Diagnose und Behandlung von Krankheiten.

Abbildung 4. ChIP-Rx zeigt epigenomische Veränderungen in erkrankten Zellen, die auf eine Medikamentenbehandlung reagieren. (Orlando et al., 2014)

ChIP-Seq hat sich auch als wertvoll erwiesen, um Einblicke in die Rolle von Transkriptionsfaktoren während des Krankheitsverlaufs zu gewinnen. Dieses Werkzeug ermöglicht die Identifizierung von Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren und Regionen der Genregulation wie Histonmodifikationsstellen, wodurch ein tieferes Verständnis der Mechanismen, die die Genregulation steuern, ermöglicht wird. Die ChIP-Seq-Analyse kann die Verteilungsmuster von Histonmodifikationen und DNA-Methylierung im gesamten Genom bestimmen und somit epigenetische regulatorische Netzwerke sowie die Auswirkungen dieser Modifikationen auf die Genexpression und zelluläre Funktionen aufdecken. Die Ergebnisse von ChIP-Seq werden häufig in funktionalen Annotationen eingesetzt, um die biologischen Prozesse und Wege zu bestimmen, an denen regulatorische Regionen im Genom beteiligt sein könnten. Diese Perspektive klärt die biologische Funktionalität verschiedener genomischer Regionen und fördert unser Verständnis komplexer zellulärer Dynamiken.

Als eine Technik, die in verschiedenen Bereichen der biologischen Forschung, einschließlich Entwicklungsbiologie, Onkologie und Immunologie, umfassend angewendet wird, Chromatin-Immunopräzipitations-Sequenzierung (ChIP-Seq) bietet wichtige Einblicke in die Genregulation und Krankheitsmechanismen. Mit der fortwährenden Verfeinerung und Weiterentwicklung dieser Technik wird ihre Rolle bei der Enthüllung komplexer regulatorischer Mechanismen im Genom und der Entschlüsselung von Krankheitswegen zunehmend bedeutsam und allgegenwärtig werden.

Zusätzliche Lektüre:

Die Vorteile und der Arbeitsablauf von ChIP-Seq

Referenzen:

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