Bulk-Immunspektrum (TCR/BCR) Sequenzierung: Prinzipien und Anwendungen

Im Laufe der Menschheitsgeschichte hat das Immunsystem unsere formidable Verteidigungslinie gegen Krankheiten dargestellt. Zentral für diese Verteidigung sind T-Zellen und B-Zellen, die als die Hauptbestandteile der adaptiven Immunität fungieren. Diese Zellen sind mit spezialisierten Rezeptoren auf ihrer Oberfläche ausgestattet –T-Zell-Rezeptoren (TCRs) und B-Zell-Rezeptoren (BCRs), die es ihnen ermöglichen, Pathogene zu erkennen und darauf zu reagieren. Durch die Sequenzierung des Immunrepertoires können diese entscheidenden Rezeptoren umfassend untersucht werden, was wertvolle Einblicke in ihre Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gesundheit und dem Kampf gegen Krankheiten bietet. Durch das Profiling der Vielfalt und Anpassungsfähigkeit von TCRs und BCRs bietet diese Technologie eine umfassendes Verständnis des Immunsystems Strategien, die Einblicke in Immunantworten, Mechanismen der Krankheitsresistenz und potenzielle Ansätze für therapeutische Interventionen geben.

Was sind TCRs und BCRs?

TCRs und BCRs stellen kritische molekulare Komponenten des Immunsystems dar, die überwiegend an der Oberfläche von T-Zellen und B-Zellen lokalisiert sind. Diese Rezeptoren spielen spezialisierte Rollen bei der Erkennung und Reaktion auf spezifische Antigene und bilden somit ein Fundament der Immunantwort.

Struktur und Zusammensetzung von TCRs

TCRs bestehen aus zwei unterschiedlichen Polypeptidketten, typischerweise einer Alpha (α) und einer Beta (β) Kette. In bestimmten Untergruppen von T-Zellen können diese Ketten jedoch alternativ aus Gamma (γ) und Delta (δ) Varianten bestehen. Jede Kette ist durch das Vorhandensein einer variablen (V) Region und einer konstanten (C) Region gekennzeichnet, wobei die variable Region hauptsächlich an der Antigen-Erkennung beteiligt ist. Diese strukturelle Variabilität ist entscheidend, da sie es den TCRs ermöglicht, eine Vielzahl von Antigenen zu binden, was ein grundlegender Aspekt der adaptiven Immunität ist.

Struktur und Zusammensetzung von BCRs

Im Gegensatz dazu sind BCRs membranständige Immunglobuline (mIg), die auf der Oberfläche von B-Zellen exprimiert werden. Diese Rezeptoren können in fünf isotypischen Formen existieren: IgM, IgD, IgG, IgA und IgE. Jeder BCR ist mit zwei identischen schweren Ketten und zwei identischen leichten Ketten strukturiert, die eine Y-förmige Konfiguration bilden. Dieses strukturelle Design ermöglicht es den BCRs, eine Vielzahl von Antigenen effektiv zu erkennen und spielt eine unverzichtbare Rolle in der humoralen Immunität.

Abbildung 1. Struktur und Zusammensetzung von TCRs und BCRs

Die funktionalen Rollen und Mechanismen von TCR und BCR im Immunsystem

TCR-Typen und ihre unterschiedlichen Rollen

Es gibt zwei Hauptklassen von TCRs: αβ TCRs und γδ TCRs. Die Mehrheit der T-Zellen exprimiert αβ TCRs, die überwiegend endogene Antigene erkennen, die von MHC-Klasse-I-Molekülen präsentiert werden, einschließlich Peptidfragmenten, die von viralen oder tumorassoziierten Proteinen stammen. Im Gegensatz dazu sind γδ TCRs häufiger in bestimmten Geweben zu finden, wie zum Beispiel im Magen-Darm-Trakt und in der Haut. Diese γδ TCRs zeigen einzigartige Fähigkeiten, indem sie nicht-peptidische Antigene erkennen, wie Lipide und Stoffwechselprodukte, und spielen somit spezialisierte Rollen in bestimmten Immunantworten.

BCR-Funktion und Aktivierung

Im Gegensatz zu TCRs erkennen und binden BCRs freie Antigene direkt, unabhängig von der Beteiligung von MHC-Molekülen. Die Spezifität der BCRs ist hochgradig verfeinert; jede B-Zelle exprimiert einen einzigartigen BCR, der ein spezifisches Antigen identifizieren kann. Nach der Bindung an ihr spezifisches Antigen wird die B-Zelle aktiviert und kann sich entweder in eine Plasmazelle oder eine Gedächtnis-B-Zelle differenzieren. Aktivierte Plasmazellen produzieren große Mengen von Antikörpern, die die Antigenbindungsstelle mit dem ursprünglichen BCR teilen. Diese Antikörper erfüllen entscheidende Funktionen, einschließlich der Neutralisierung von Antigenen und der Verbesserung der Antigeneliminierung aus dem Körper, und unterstützen somit die adaptiven Immunabwehrmechanismen.

Experimentelle Vorgehensweise

Prinzip der Konstruktion einer RNA-Immuno-Repertoire-Bibliothek: Molekulare Barcodes und 5' RACE

Die Konstruktion von RNA-basierten Immuno-Repertoire-Bibliotheken Die Verwendung von molekularen Barcodes in Verbindung mit der 5' Rapid Amplification of cDNA Ends (5' RACE) ermöglicht eine hochauflösende Profilierung der Vielfalt von Immunrezeptoren. Diese Methodik erweist sich als besonders effektiv, um die native Transkript-Abundanz von Immunglobulin (Ig) und TCR-RNA zu erfassen, wodurch Einblicke in sowohl die Sequenzvielfalt als auch die Expressionsniveaus gewonnen werden.

5' RENNEN für umfassende Rezeptorprofilierung

Die 5' RACE-Technik wird umfassend eingesetzt, um die vollständigen variablen (V) Regionen von Ig- und TCR-Transkripten von ihren 5' Enden zu erfassen. Diese Methodik beginnt mit der reversen Transkription, bei der ein spezifischer Primer an die konstante (C) Region des Transkripts anlagert und die Synthese von komplementärer DNA (cDNA) unterstützt. Die nachfolgenden Verfahrensschritte beinhalten das Erfassen und Amplifizieren des 5' Endes, was es den Forschern ermöglicht, die vollständige V-Region abzurufen, die entscheidend für das Verständnis der Antigenbindungsvielfalt von Immunrezeptoren ist. Diese Technik ist besonders vorteilhaft, da sie den natürlichen Beginn des Transkripts erfasst und so eine genauere Darstellung der Architektur der VDJ-Region gewährleistet.

Molekulare Barcodes zur Reduzierung von Amplifikationsbias

Die Integration von molekularen Barcodes – kurzen, zufälligen Nukleotidsequenzen, die vor der Amplifikation an jedes RNA-Molekül angehängt werden – spielt eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle von Amplifikationsbias und der Erleichterung der Quantifizierung der Transkriptmenge. Molekulare Barcodes werden während der initialen reversen Transkriptionsphase integriert, wobei jedes RNA-Molekül mit einer charakteristischen Sequenz markiert wird. Während der anschließenden Amplifikations- und Sequenzierungsprozesse ermöglichen diese molekularen Barcodes die Unterscheidung zwischen ursprünglichen RNA-Molekülen und PCR-Duplikaten, was eine genaue Bewertung der Transkriptmenge ermöglicht und Amplifikationsartefakte reduziert. Dieser Schritt ist entscheidend, um quantitative Einblicke in die Vielfalt des Immunrepertoires zu gewinnen und eine zuverlässige Normalisierung über unterschiedliche Transkripte hinweg zu ermöglichen.

Kombinierte Anwendung in der Hochdurchsatz-Sequenzierung

Gemeinsam fördern die Strategien von 5' RACE und molekularen Barcodes einen hochdurchsatzfähigen, quantitativen Ansatz zur RNA. Immuno-Repertoire-ProfilingWährend die 5' RACE eine umfassende Erfassung der V-Region des Immunrezeptors gewährleistet, verbessern molekulare Barcodes die Genauigkeit bei der Quantifizierung der ursprünglichen RNA-Moleküle. In Kombination mit der Next-Generation-Sequenzierung ermöglichen diese Methoden eine umfassende Charakterisierung von Immunrepertoires und liefern wichtige Daten für die Forschung in der Immunologie, der Impfstoffentwicklung und der Erforschung immunbedingter Erkrankungen.

Abbildung 2. Prinzip der Konstruktion einer RNA-Immuno-Repertoire-Bibliothek

Vorteile und Einschränkungen der Konstruktion von RNA-basierten Immuno-Repertoire-Bibliotheken

Erhöhte Sensitivität: RNA-basierte Ansätze bieten eine verbesserte Sensitivität aufgrund der Anwesenheit mehrerer mRNA-Kopien pro Zelle, was die Amplifikation und die Integration molekularer Barcodes erleichtert.

Fehlerkorrektur durch molekulare Barcodes: Die Einführung der Technologie molekularer Barcodes hilft dabei, den Zustand vor der PCR-Amplifikation zu rekonstruieren, was die Korrektur von Fehlern ermöglicht, die aus den PCR- und Sequenzierungsprozessen resultieren.

Umfassende Sequenzaufnahme mit 5' RACE: Die Methode der 5' schnellen Amplifikation von cDNA-Enden (5' RACE) ermöglicht die Amplifikation von vollständige Immunrepertoire-GensequenzenDiese Technik offenbart nicht nur neuartige Exon-Gene und Mutationsarten, sondern passt sich auch an verschiedene Sequenzierungsleselängen an, wodurch die Erfassung von vollständigen Sequenzen der CDR3-Region oder kompletten TCR/BCR-Sequenzen ermöglicht wird.

Musterqualitätsanforderung: Diese Methode erfordert hochwertige Proben, um genaue und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.

Prinzip der Konstruktion einer DNA-basierten Immun-Repertoire-Bibliothek: Multiplex-PCR-Technologie

Der Aufbau von DNA-basierten Immun-Repertoire-Bibliotheken beruht auf der Nutzung der Multiplex-PCR-Technologie, einer robusten Methodik, die in der Lage ist, mehrere Genabschnitte innerhalb eines einzigen Reaktionsrahmens gleichzeitig zu amplifizieren. Dieser methodische Ansatz ist besonders vorteilhaft bei der Erforschung von Immunrepertoires, da er die umfassende Erfassung von Ig- und TCR-Genabschnitten ermöglicht. Solche Abschnitte sind durch eine erhebliche Vielfalt gekennzeichnet, die das Ergebnis von Rekombinations- und Mutationsereignissen ist.

Bei der Konstruktion von Immuno-Repertoire-Bibliotheken nutzt die Multiplex-PCR sorgfältig gestaltete Primerpaare, die strategisch darauf ausgelegt sind, die variablen, Diversitäts- und Verbindungsregionen (VDJ) der Ig- oder TCR-Gene anzusprechen. Diese Primer müssen eine hohe Spezifität aufweisen, um die Amplifikation einer umfassenden Palette einzigartiger VDJ-Kombinationen zu ermöglichen und gleichzeitig die off-target Amplifikation zu reduzieren. Durch das präzise Design der Primer gelingt es dieser Technik, ein breites Spektrum an Diversität der Immunrezeptoren innerhalb einer gegebenen Probe zu erfassen, was ein kritischer Faktor für Anwendungen wie Immunprofiling, Krankheitsforschung und therapeutische Entwicklung ist.

Darüber hinaus werden während des Amplifikationsprozesses häufig Barcode-Sequenzen in die PCR-Produkte integriert. Diese Barcodes erleichtern die Unterscheidung einzelner Proben in den nachfolgenden Hochdurchsatz-Sequenzierungsphasen, wodurch eine genaue Verfolgung und vergleichende Analyse über eine Vielzahl von Bibliotheken hinweg ermöglicht wird. Dieser Schritt erweist sich als besonders vorteilhaft in groß angelegten Studien, da er die parallele Verarbeitung zahlreicher Proben ermöglicht. Folglich reduziert er sowohl den zeitlichen als auch den finanziellen Aufwand erheblich, während er gleichzeitig die Tiefe der analytischen Untersuchung erhöht.

Abbildung 3. Prinzip der Konstruktion einer DNA-Immuno-Repertoire-Bibliothek

Vorteile und Einschränkungen des DNA-basierten Immun-Repertoire-Bibliotheksaufbaus

• Eignung für degradierte Proben: DNA-basierte Methoden eignen sich gut für Proben, bei denen die RNA-Qualität nicht zuverlässig aufrechterhalten werden kann, wie z. B. bei degradierten RNA-Proben oder formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Präparaten.
• Quantitative Analysefähigkeit: DNA-basierte Ansätze ermöglichen eine relativ quantitative Analyse von Lymphozytenpopulationen, einschließlich T- und B-Zellen, da jede Kopie von genomischer DNA (gDNA) direkt mit einer einzelnen Zelle korreliert und eine Eins-zu-eins-Basis für die Zellquantifizierung bietet.
• Gezielte Amplifikation der CDR3-Region: Diese Methode amplifiziert hauptsächlich die komplementaritätsbestimmende Region 3 (CDR3), ein kritisches Segment der Immunoglobulin- und T-Zell-Rezeptor-Gene, das für die Antigenbindung und Spezifität verantwortlich ist.
• Niedrigere Anforderungen an die Probenqualität: Die DNA-basierte Immunrepertoire-Konstruktion erfordert eine niedrigere Probenqualität im Vergleich zu RNA-basierten Methoden, was eine einfachere Handhabung und Analyse ermöglicht.

Anwendungen der TCR/BCR-Forschung in der Präzisionsmedizin

Die Analyse von tumorspezifischen Antigenen auf patientenabgeleiteten Krebszellen ermöglicht die Entwicklung von personalisierten TCR-T (T-Zell-Rezeptor-transduzierten T-Zellen) Therapien. Zum Beispiel hat sich die TCR-T-Zelltherapie, die auf Melanome abzielt, als vielversprechender Ansatz in der Onkologie herausgestellt.

• TitelFunktionale Analyse von peripheren und intratumoralen neoantigen-spezifischen TCRs, die bei einem Patienten mit Melanom identifiziert wurden
• Tagebuch: Journal für Immuntherapie von Krebs
• Impact-Faktor10,3
• VeröffentlichungsdatumSeptember 2021

Zusammenfassung

Eine Fallstudie über metastasierenden malignen Melanomen wurde durchgeführt, um neoantigen-spezifische T-Zell-Antworten im Rahmen der Regulierung von Immun-Checkpoint zu charakterisieren. Die Forscher verwendeten Immunpeptidomik und computergestützte Vorhersage, um Neoantigene zu identifizieren, gefolgt von TCR-Sequenzierung um TCRs, die spezifisch für diese Neoantigene sind, aus dem Immunrepertoire des Patienten zu isolieren.

Nachfolgende in vitro multiparametrische Analysen - einschließlich funktioneller Affinitätsbewertungen, Multiplex-Zytokinsekretionsassays und Kreuzreaktivitäts-Screenings - wurden verwendet, um die antitumorale Wirksamkeit dieser TCRs zu bewerten. Ausgewählte mutierte Peptidliganden zeigten immunogenes Potenzial und wiesen Bindungsaffinitäten auf, die mit menschlichen Leukozytenantigen (HLA)-Komplexen vergleichbar waren. Diese Peptidliganden zeigten auch unterschiedliche Bindungseigenschaften im Vergleich zu ihren Wildtyp-Gegenstücken in molekulardynamischen Simulationen.

Interessanterweise wiesen TCRs, die diese Neoantigene erkennen, unterschiedliche funktionale und Frequenzprofile auf. TCRs mit vergleichsweise niedrigerer funktionaler Affinität zeigten in vivo robuste antitumorale Immunantworten, ein Befund, der die potenzielle Wirksamkeit dieser TCRs trotz ihrer moderaten Affinität unterstreicht. Darüber hinaus wurden diese TCRs in hohen Frequenzen nachgewiesen, insbesondere im Tumorgewebe, in Lymphknoten und in verschiedenen Blutproben, was auf eine verlängerte Persistenz hinweist. Diese Persistenz steht im Einklang mit einem reduzierten Aktivierungsmuster, das auf die primäre in vitro-Stimulation folgt, und hebt das Potenzial für eine langfristige antitumorale Wirksamkeit im Tumormikroumfeld hervor.

Anwendungen der Immuntherapie

Die Nutzung der Spezifität von TCRs und BCRs hat die Entwicklung innovativer bispezifischer Antikörper wie Blinatumomab ermöglicht, die spezifische Leukämie-Subtypen anvisieren und bei der Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit für verschiedene Malignome helfen.

• Titel: Neoadjuvante Tislelizumab plus stereotaktische Körperbestrahlung und adjuvantes Tislelizumab bei resektablem hepatozellulärem Karzinom im frühen Stadium: Die Notable-HCC Phase Ib Studie
• Journal: Naturwissenschaftliche Kommunikation
• Impact Faktor16,6
• VeröffentlichungsdatumApril 2024

Studienaufbau

Diese Untersuchung, eine einzentralisierte, offene Phase-Ib-Studie (NCT05185531), schloss 20 Patienten mit einer Diagnose von Leberzellkarzinom (HCC) im Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC) Stadium 0-A ein. Die Teilnehmer erhielten drei Sitzungen stereotaktischer Körperbestrahlung (SBRT) in Kombination mit zwei Zyklen neoadjuvanter PD-1-Antikörpertherapie (Tislelizumab). Tumorgewebe- und periphere Blutproben wurden vor und nach dem chirurgischen Eingriff zur pathologischen Beurteilung und Immunhistochemie entnommen. RNA-Sequenzierung, und TCR-Sequenzierung.

Primäre Endpunkte

Wichtige Endpunkte umfassten chirurgische Verzögerung, radiologische und pathologische Tumorreaktion sowie Sicherheitsbewertung. Vorläufige Ergebnisse deuteten auf eine günstige Sicherheit und antitumorale Wirksamkeit der Kombination aus neoadjuvanter PD-1-Hemmung und SBRT bei Patienten mit resektablem HCC im Frühstadium hin. Darüber hinaus erwies sich die TCR-Sequenzierung als entscheidend für die Bewertung der Immunaktivierung nach der neoadjuvanten Therapie und zur Aufklärung ihrer Mechanismen.

Bewertung der Wirksamkeit von Immuntherapien durch TCR-Repertoire-Analyse

Die Wirksamkeit der neoadjuvanten PD-1-Antikörper-Immuntherapie wurde durch die Analyse von Veränderungen im TCR-Repertoire vor und nach der Behandlung bewertet. Die Analyse nach der Behandlung zeigte einen erheblichen Anstieg neuartiger TCR-Klone, was auf eine robuste immuntherapeutische Antwort hindeutet. Die TCR-Sequenzierung identifizierte eine signifikante Präsenz neuer, hochfrequenter TCR-Klone, was die Hypothese weiter unterstützt, dass die neoadjuvante Behandlung antitumorale Effekte durch die Expansion und den Austausch tumor-spezifischer T-Zell-Populationen fördert.

Therapeutische Strategien für Autoimmunerkrankungen

Fortschritte in der Analyse abweichender T-Zell-Rezeptor (TCR)-Expressionsmuster bei Autoimmunerkrankungen bieten potenzielle Wege für die Entwicklung von TCR-zielgerichteten Therapeutika. Solche Therapeutika sind darauf ausgelegt, die TCR-Aktivität zu modulieren und so autoimmune Reaktionen abzuschwächen. Beispielsweise veranschaulichen biologische Mittel, die für Erkrankungen wie rheumatoide Arthritis maßgeschneidert sind, diesen Ansatz.

• Titel Analyse des B-Zell-Rezeptor-Repertoires bei sechs immunvermittelten Erkrankungen
• Journal: Natur
• Impact Faktor42,778
• VeröffentlichungsdatumSeptember 2019

Studienübersicht

Diese Studie führte eine umfassende Analyse der B-Zell-Rezeptor (BCR)-Repertoires über sechs Autoimmunerkrankungen hinweg durch, wobei spezifisch periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) von 209 Patienten mit systemischem Lupus erythematodes (SLE), ANCA-assoziierter Vaskulitis, Morbus Crohn, Behçetscher Krankheit, eosinophiler Granulomatose mit Polyangiitis (EGPA) und IgA-Vaskulitis untersucht wurden. Darüber hinaus wurden PBMC-Proben von 19 gesunden Kontrollen analysiert. Die BCRs in diesen Proben wurden mit der Illumina MiSeq-Plattform unter Verwendung von paired-end 300 bp Reads (PE 300) sequenziert.

Methodik

Um eine hochqualitative Sequenzierung der BCRs sicherzustellen, implementierte die Studie einen Multiplex-PCR-Ansatz unter Verwendung von Primern, die für die V(D)J-Regionen entworfen wurden, ergänzt durch universelle Primer, die auf konstante (C) Regionen abzielen. Diese Strategie ermöglichte eine robuste Amplifikation und den anschließenden Aufbau einer umfassenden BCR-Sequenzierungsbibliothek. Die gewonnenen Daten ermöglichten einen mehrschichtigen analytischen Rahmen, der untersuchte:

Einfluss des Krankheitsstatus und Alters: Die Zusammenhänge zwischen den BCR-Eigenschaften und sowohl dem Krankheitszustand als auch dem Alter der Patienten wurden bewertet.

Antikörper-Subtyp-Verteilung: Die Variation der Antikörper-Isotypen wurde unter verschiedenen Krankheitsbedingungen untersucht.

IGHV-Genverwendung: Die Häufigkeit der Verwendung von Immunoglobulin schweren variablen (IGHV) Genen wurde bewertet, um krankheitsspezifische Muster zu identifizieren.

CDR3-Länge und Klonotypenvielfalt: Vergleichende Analysen der Länge der komplementär bestimmenden Region 3 (CDR3) und der Vielfalt der BCR-Klonotypen wurden durchgeführt, um die krankheitsspezifische klonale Expansion von B-Zellen zu erhellen.

Klassenswitch: Muster des Isotypenswitchs wurden untersucht, um die Mechanismen der immunologischen Anpassung im Kontext von Krankheiten zu verstehen.

Längsschnittliche BCR-Variabilität als Reaktion auf die Behandlung: Bei einer Untergruppe von Patienten, die spezifischen Behandlungen unterzogen wurden, wurde die Entwicklung der BCR-Repertoires überwacht, um behandlungsbedingte Veränderungen zu erkennen.

Schlussfolgerungen und Implikationen

Diese Studie bietet eine umfassende Charakterisierung der BCR-Repertoires bei Autoimmunerkrankungen und zeigt komplexe strukturelle Merkmale und Variationen, die mit Krankheitszuständen verbunden sind. Diese Erkenntnisse tragen wertvolles Wissen zu den pathogenetischen Mechanismen bei, die Autoimmunerkrankungen zugrunde liegen, und ebnen den Weg für gezieltere therapeutische Strategien.

Fazit

Während der pathogenen Invasion mobilisiert das Immunsystem des Wirts eine Vielzahl von Immunzellen, die jeweils durch unterschiedliche Transkriptionsprofile gekennzeichnet sind. Antigene werden über den B-Zell-Rezeptor (BCR) auf B-Zellen und den T-Zell-Rezeptor (TCR) auf T-Zellen erkannt, wobei Untergruppen dieser Zellen eine klonale Expansion durchlaufen und Populationen bilden, die identische BCR- oder TCR-Sequenzen exprimieren. Dieses Phänomen verdeutlicht die multidimensionale Heterogenität der Immunantwort beim Zusammentreffen mit Pathogenen. Durch die Analyse der Sequenzvielfalt von BCRs und TCRs können Einblicke in die klonale Verteilung innerhalb des immunologischen Mikroumfelds gewonnen werden, was das Verständnis der Mechanismen vorantreibt, durch die der Organismus eine Abwehr gegen die Invasion von Pathogenen aufbaut.

Die TCR-Sequenzierungstechnologie zeigt ein erhebliches Potenzial in der immuntherapeutischen Forschung. Sie fördert nicht nur den Fortschritt im Bereich der personalisierten Medizin, sondern hat auch eine beträchtliche Bedeutung bei der Entdeckung und Optimierung neuer Immuntherapien.

Referenzen:

1. Bräunlein E, Lupoli G, Füchsl F, et al. Funktionale Analyse von peripheren und intratumoralen neoantigen-spezifischen TCRs, die bei einem Patienten mit Melanom identifiziert wurden. J Immunother Cancer. 2021;9(9):e002754.
2. Bashford-Rogers RJM, Bergamaschi L, McKinney EF, et al. Analyse des B-Zell-Rezeptor-Repertoires bei sechs immunvermittelten Erkrankungen. Nature. 2019;574(7776):122-126.
3. Li, Z., Liu, J., Zhang, B. et al. Neoadjuvante Tislelizumab plus stereotaktische Körperbestrahlung und adjuvantes Tislelizumab bei resektablem hepatozellulärem Karzinom im frühen Stadium: die Notable-HCC Phase 1b Studie. Nat Commun 15, 3260 (2024).