Wie man Amplicon-Sequenzierungsdaten analysiert: Werkzeuge, Tipps und Pipelines

Amplicon-Sequenzierung ist jetzt ein Grundpfeiler von mikrobielle Profilierung und gezielte genetische Analysen, die für ihre Präzision und Kosteneffizienz geschätzt werden. Diese Methode bietet eine optimierte Möglichkeit, spezifische DNA-Regionen mit hoher Auflösung zu untersuchen, von Studien zum Mikrobiom des Darms über Bewertungen der biologischen Vielfalt in der Umwelt bis hin zur Entdeckung von Biomarkern für Krankheiten.

Der technische Erfolg hängt jedoch von mehr als nur der Sequenzierung ab. Zuverlässige Erkenntnisse hängen davon ab, wie gut die Daten verarbeitet werden – von den anfänglichen Qualitätsprüfungen bis hin zur taxonomischen Klassifikation und statistischen Vergleich. Dieser Leitfaden skizziert einen schrittweisen Rahmen zur Analyse von Amplicon-Sequenzierungsdaten unter Verwendung vertrauenswürdiger Werkzeuge wie QIIME2, DADA2 und LEfSe.

Egal, ob Sie ein Forschungwissenschaftler sind, der mikrobielle Veränderungen validiert, oder ein CRO-Partner, der genomische Erkenntnisse liefert, dieser Artikel bietet umsetzbare Tipps und Strategien zur Pipeline-Gestaltung, die robuste, reproduzierbare Ergebnisse unterstützen.

Einführung in die Amplicon-Sequenzierung

Gezielte Amplifikation: Ein intelligenter Ansatz für fokussiertes Sequenzieren

Amplicon-Sequenzierung ist zu einer bevorzugten Methode zur Analyse spezifischer DNA-Regionen mit hoher Präzision und Effizienz geworden. Anstatt ein gesamtes Genom zu sequenzieren, amplifiziert diese Technik gezielt Zielregionen mithilfe sorgfältig gestalteter Primer. Diese Primer binden an die angrenzenden Bereiche von Interesse, wodurch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mehrere Kopien dieser Fragmente erzeugen kann.

Diese gezielte Methode bietet klare Vorteile:

• Es unterstützt Hochdurchsatz-Sequenzierung zu geringeren Kosten als breitere Ansätze wie Metagenomik.
• Es liefert tiefgehende Einblicke in die genetische Variation innerhalb spezifischer Loci.
• Es reduziert Hintergrundgeräusche und hilft Forschern zu verstehen, was am wichtigsten ist.

Die Amplicon-Sequenzierung ist zu einem Standardwerkzeug in der Mikrobiomforschung geworden. Durch die Fokussierung auf das 16S rRNA-Gen bei Bakterien oder die ITS-Region bei Pilzen können Wissenschaftler genau identifizieren, welche Mikroben vorhanden sind und in welchen Verhältnissen. Ob bei der Untersuchung des menschlichen Darms, landwirtschaftlicher Böden oder aquatischer Systeme, diese Methode zeigt die mikrobielle Vielfalt, die Gesundheit, Krankheit und die Funktion von Ökosystemen zugrunde liegt.

Für einen detaillierten Überblick über die Prinzipien und den Arbeitsablauf der 16S/18S/ITS-Amplicon-Sequenzierung können Sie auf diese Ressource verweisen: Prinzipien und Arbeitsablauf der 16S/18S/ITS-Amplikon-Sequenzierung

Amplicon-Sequenzierung vs. MetagenomikWelche sollten Sie verwenden?

Während beide Methoden ihren Wert haben, dienen sie unterschiedlichen Zwecken. Hier ist, wie sie sich vergleichen:

• Kosten: Die Amplicon-Sequenzierung ist typischerweise kostengünstiger, da sie kleinere, spezifische DNA-Regionen anvisiert. Metagenomik erfordert die Sequenzierung sämtlicher genetischer Materialien, was ressourcenintensiver ist.
• Datenvolumen: Metagenomische Datensätze sind riesig und bieten umfassende Einblicke in die Gemeinschaftsfunktion. Amplicon-Daten sind schlanker, aber ideal für die taxonomische Profilierung.
• Anwendungsbereich:
• Verwenden Sie Amplicon-Sequenzierung, wenn Ihr Ziel die Struktur oder Vielfalt von Mikrobengemeinschaften ist.
• Wählen Sie Metagenomik, wenn Sie das metabolische Potenzial oder funktionelle Gene erkunden möchten.

Zum Beispiel verwendete eine Studie von Zhang et al. (2019) die 16S rRNA-Gen-Amplikon-Sequenzierung, um die mikrobielle Vielfalt in verschiedenen Bodenproben zu untersuchen, und zeigte dabei unterschiedliche Gemeinschaftsstrukturen, die von Umweltfaktoren beeinflusst wurden. Im Gegensatz dazu nutzten Ye et al. (2012) die Metagenom-Sequenzierung, um mikrobielle Gemeinschaften in Abwasserbehandlungs-Bioreaktoren zu analysieren und funktionale Gene zu entdecken, die mit Nährstoffentfernungsprozessen assoziiert sind. Diese Studien veranschaulichen, wie die Wahl zwischen Amplikon-Sequenzierung und Metagenomik von den Forschungszielen abhängt - ob der Fokus auf der taxonomischen Profilierung oder dem funktionalen Potenzial liegt.

Abbildung 1. Die relative Häufigkeit der dominanten Bodenbakterien-Phyla variiert über verschiedene Landtypen. Die Daten spiegeln die OTU-basierte Gemeinschaftszusammensetzung wider. Adaptierte von Zhang et al., 2017.

Für einen detaillierten Vergleich dieser Methoden sollten Sie diesen Artikel lesen: Der Workflow und die Anwendungen der Amplicon-Sequenzierung

Datenvorverarbeitung

Schritt Eins: Überprüfen der Datenqualität mit FastQC

Bevor Sie mit einer nachgelagerten Analyse fortfahren, ist es wichtig, die Qualität der Rohdaten zu bewerten. Eines der am häufigsten verwendeten Werkzeuge dafür ist FastQC, das einen schnellen und intuitiven Überblick über die Sequenzierungsreads bietet.

Wichtige Kennzahlen umfassen:

• Phred-Score: Dies misst die Wahrscheinlichkeit von Basisaufruffehlern. Ein Wert über Q20 oder Q30 wird allgemein als hochqualitativ angesehen.
• GC-Gehalt: Sequenzen mit abnormalem GC-Gehalt können auf Kontamination oder Sequenzierungsbias hinweisen. FastQC erstellt GC-Diagramme, um solche Anomalien zu erkennen.

Diese Diagnosen helfen Forschern, frühzeitig minderwertige Reads zu identifizieren und Fehler zu vermeiden, die später die Ergebnisse verfälschen könnten. Eine Studie zum menschlichen Mikrobiom, die in Microbiome veröffentlicht wurde, verwendete FastQC, um niedrigwertige Reads basierend auf Phred- und GC-Metriken zu kennzeichnen und zu entfernen, wodurch die Datenzuverlässigkeit vor der taxonomischen Profilierung verbessert wurde.

Integrierte Qualitätskontrollmodule bieten ähnliche Funktionen für Benutzer, die innerhalb der QIIME2-Umgebung arbeiten. Dazu gehören grundlegende Trimm- und Filter-Workflows, die QIIME2 zu einer praktischen Option für die durchgängige Vorverarbeitung machen.

Schritt Zwei: Daten kürzen, filtern und bereinigen

Sobald Sie die Qualität bewertet haben, besteht der nächste Schritt darin, die Rohsequenzen zu bereinigen. Dieser Schritt umfasst typischerweise:

• Schneiden von minderwertigen Enden: Werkzeuge wie DADA2 verwenden statistische Modelle, um echte biologische Sequenzen abzuleiten und Sequenzierungsfehler zu entfernen. DADA2 ist besonders gut darin, Basenaustausche und Indels zu identifizieren.
• Primer entfernen: Wenn Primer in den Reads verbleiben, können sie die genaue Clusterbildung beeinträchtigen. Cutadapt ist ein flexibles und effizientes Tool, das nach diesen unerwünschten Primersequenzen sucht und sie entfernt.
• Chimären filtern: Chimären sind künstliche DNA-Konstrukte, die während der PCR entstehen. Sie spiegeln nicht die wahre Biologie wider und müssen eliminiert werden. UCHIME hilft, diese zu erkennen, indem es die Reads mit vertrauenswürdigen Referenzdatenbanken vergleicht.

Eine häufig zitierte Studie von Callahan et al. zeigte einen robusten Workflow unter Verwendung von DADA2 zur Rauschunterdrückung, Cutadapt zur Entfernung von Primern und UCHIME zur Chimärenfilterung, der eine genaue Profilierung von mikrobielle Gemeinschaften in verschiedenen menschlichen und Umweltproben ermöglicht.Naturmethoden, 2016, doi:10.1038/nmeth.3869).

Für ein vertieftes Verständnis dieser Vorverarbeitungsschritte konsultieren Sie bitte diese Ressource: Amplicon-Sequenzierungsanalyse: OTU vs. ASV

Sequenzalignment und Clusterbildung

Von Ähnlichkeit zu Arten: OTU-basierte Clusterbildung

Die Gruppierung ähnlicher DNA-Sequenzen ist ein Grundpfeiler der Amplicon-Sequenzierungsanalyse. Traditionell wurde dies mit Operational Taxonomic Units (OTUs) durchgeführt - Gruppen von Sequenzen, die ein definiertes Maß an Ähnlichkeit teilen, typischerweise 97 %.

Beliebte Werkzeuge für die OTU-Clusterbildung sind:

• UCLUST, das einen gierigen Algorithmus verwendet, um Sequenzen nach Länge zu sortieren und sie basierend auf Ähnlichkeitsschwellen zu gruppieren.
• Mothur bietet mehrere Clusterstrategien (z. B. Durchschnittsnachbar oder entferntester Nachbar), um das Clustern basierend auf ökologischen Zielen zu optimieren.

Der 97%-Ähnlichkeitsschwellenwert ist weit verbreitet akzeptiert, da Bakterien, die dieses Maß an Ähnlichkeit in ihren 16S rRNA-Genen aufweisen, oft als dieselbe Art betrachtet werden. Er findet ein Gleichgewicht zwischen Übersegmentierung und übermäßiger Zusammenfassung.

Zum Beispiel wendeten Barberán et al. eine OTU-basierte Clusteranalyse an, um mikrobielle Gemeinschaften in 151 Bodenproben aus verschiedenen Ökosystemen der USA zu untersuchen. Durch die Identifizierung von Ko-Vorkommen-Netzwerken und Umweltgradienten zeigten sie, wie sich mikrobielle Populationen als Reaktion auf Faktoren wie pH und Trockenheit verändern. ISME Journal.doi: 10.1038/ismej.2011.119)

ASVs: Höhere Auflösung, Größere Präzision

Amplicon-Sequenzvarianten (ASVs) haben sich als genauere Alternative zu OTUs herausgestellt. Im Gegensatz zu OTUs, die auf einem festen Ähnlichkeitsschwellenwert basieren, erfassen ASVs tatsächliche biologische Sequenzen mit einer Auflösung auf Einzel-Nukleotid-Ebene - ohne Clusterbildung.

Zwei führende ASV-Algorithmen sind:

• DADA2, das ein parametrisches Fehlermodell verwendet, um Sequenzierungsfehler zu korrigieren und echte Sequenzen abzuleiten.
• UNOISE3, eine nicht-parametrische Methode, die Rauschen basierend auf Mustern der Lesereichweite herausfiltert. Sie wird häufig innerhalb der USEARCH- oder UPARSE-Frameworks verwendet.

Der Vorteil? Auf Stammebene Auflösung. ASVs ermöglichen es Ihnen, zwischen mikrobiellen Varianten zu unterscheiden, die mit OTU-basierten Methoden zusammenfallen würden.

In einer hochkarätigen Studie, die in Cell veröffentlicht wurde, verfolgten Wastyk et al. (2021), wie diätetische Interventionen das menschliche Mikrobiom im Darm modulieren. Durch die Verwendung einer ASV-basierten Analyse erfassten die Forscher subtile, stammbezogene Veränderungen in der mikrobielle Zusammensetzung, die mit einer ballaststoffreichen oder fermentierten Lebensmittel-Diät verbunden waren - Unterschiede, die traditionelle OTU-basierte Methoden wahrscheinlich übersehen würden. Diese feinkörnigen Einblicke verknüpften spezifische mikrobielle Veränderungen mit der Immunmodulation und hoben die Kraft der hochauflösenden Mikrobiom-Profilierung hervor.

Abbildung 1. Die Diversität des Mikrobioms im Darm nahm bei den Teilnehmern, die sich von einer Ernährung mit vielen fermentierten Lebensmitteln ernährten, signifikant zu, wie durch die Analyse auf ASV-Ebene gezeigt wird. Adaptierte von Wastyk et al., 2021.

Für eine umfassende Einführung in ASVs und ihre Vorteile können Sie diese Ressource erkunden: Einführung in Amplicon-Sequenzvarianten.

Taxonomische Zuordnung

Die richtige Datenbank und den richtigen Klassifikator für zuverlässige Ergebnisse auswählen

Sobald die Sequenzen entrauscht und gruppiert sind, besteht der nächste Schritt darin, "wer da ist" in der Probe zu bestimmen. Dies geschieht durch die taxonomische Zuordnung, bei der DNA-Reads mit bekannten mikrobiellen Taxa unter Verwendung kuratierter Datenbanken und Klassifikationsalgorithmen abgeglichen werden.

Drei häufig verwendete Referenzdatenbanken sind:

• Silva: Jährlich aktualisiert bietet Silva eine umfassende Abdeckung von Bakterien, Archaeen und eukaryotischen Mikroben, was es ideal für umfassende taxonomische Studien macht.
• Greengenes: Obwohl es historisch gesehen für die 16S rRNA-Analyse beliebt war, wurde Greengenes seit 2013 nicht mehr aktualisiert. Seine Verwendung ist jetzt hauptsächlich auf ältere Pipelines beschränkt.
• RDP (Ribosomal Database Project): Bekannt für seine benutzerfreundlichen Werkzeuge und häufigen Updates, ist RDP vorteilhaft für sowohl bakterielle als auch pilzliche Klassifizierungsaufgaben.

In QIIME2 ist das q2-feature-classifier-Plugin das bevorzugte Werkzeug zur Taxonomiezuweisung. Es verwendet einen bayesschen Klassifikationsalgorithmus, der die Wahrscheinlichkeit berechnet, dass eine gegebene Sequenz zu einem bestimmten Taxon gehört, basierend auf der Sequenzähnlichkeit und den vorherigen taxonomischen Wahrscheinlichkeiten aus der Referenzdatenbank.

Ein Benchmark-Vergleich, der in Nature Microbiology veröffentlicht wurde, bewertete mehrere Kombinationen von Datenbank- und Klassifikatoren. Die Studie ergab, dass die Leistung je nach Probenart und Auflösungsbedarf variierte. Die Kombination von Silva mit dem QIIME2-Klassifikator für die komplexesten mikrobiellen Gemeinschaften ergab die höchste Genauigkeit sowohl auf Gattungs- als auch auf Artenebene.

Verstehen von taxonomischen Profilen

Sobald die Taxonomie zugewiesen ist, müssen Forscher die relativen Abundanzen der mikrobiellen Gruppen in jeder Probe interpretieren. Rohzählungen allein sind jedoch nicht ausreichend – die Normalisierung ist entscheidend für sinnvolle Vergleiche.

Zwei Standardmethoden zur Skalierung der Häufigkeit sind:

• TSS (Total Sum Scaling): Wandelt Zählungen in relative Prozentsätze um, indem jeder Wert durch die gesamte Leseanzahl für diese Probe dividiert wird.
• CSS (Kumulative Summen-Skalierung): Passt Variationen zwischen Proben und Sequenzierungstiefen an und bietet eine bessere Kontrolle über Verzerrungen in Hochdurchsatzstudien.

Taxonomische Daten können auf mehreren Ebenen erkundet werden - Stamm, Klasse, Gattung und darüber hinaus. Jede Ebene bietet eine andere Sichtweise:

Phylum-Ebene-Muster geben einen breiten Überblick (z. B. die Dominanz von Firmicutes und Bacteroidetes in Darmproben).

Einblicke auf Gattungsebene helfen dabei, spezifische Organismen zu identifizieren, die mit Krankheiten, Stoffwechsel oder Umweltfunktionen verbunden sind.

Der Humanes Mikrobiom-Projekt, veröffentlicht in Science, zeigte, wie die mehrstufige taxonomische Profilierung unterschiedliche mikrobielle Signaturen an verschiedenen Körperstellen aufdecken kann. Dieser schichtweise Ansatz half den Forschern, Zusammenhänge zwischen Mikrobiota und Gesundheitsauswirkungen zu kartieren und legte das Fundament für klinische Mikrobiomstudien heute.

Visualisierung und Interpretation

Visualisierung mikrobieller Gemeinschaften

Beta-Diversität in umsetzbare Erkenntnisse verwandeln

Sobald mikrobielle Profile erstellt sind, besteht die nächste Herausforderung darin, die Daten zu verstehen. Hier kommt die Visualisierung ins Spiel. Durch die Abbildung von Gemeinschaftsstrukturen in intuitiven Visualisierungen können Forscher Muster aufdecken, die in Rohdaten sonst verborgen bleiben.

Zwei weit verbreitete Werkzeuge zum Vergleich der mikrobiellen Diversität zwischen Proben sind:

• PCoA (Hauptkoordinatenanalyse): Diese lineare Methode projiziert Proben in einen niederdimensionalen Raum basierend auf paarweisen Distanzmetriken wie Bray-Curtis oder Jaccard. In einem PCoA-Diagramm sind Proben, die eng beieinander liegen, kompositionell ähnlich - ideal zum Vergleichen von Behandlung vs. Kontrolle oder Bodentypen.
• NMDS (Nicht-metrische multidimensionale Skalierung): Im Gegensatz zu PCoA bewahrt NMDS die Rangordnung der Abstände, was es robuster gegenüber nicht-normalen Daten und Ausreißern macht. Es ist vorteilhaft in hochdimensionalen, null-inflatierten Mikrobiom-Datensätzen.

Beide Ansätze bieten einen visuellen Überblick über die Beta-Diversität und helfen Forschern, zu untersuchen, wie sich mikrobielle Gemeinschaften unter verschiedenen Bedingungen, Zeitpunkten oder Standorten unterscheiden.

Werkzeuge, um Daten zum Leben zu erwecken

Interaktive Visualisierungsplattformen wie iTOL und ImageGP erleichtern die Interpretation komplexer taxonomischer Daten:

• iTOL (Interaktive Baum des Lebens): Dieses browserbasierte Tool ermöglicht es Benutzern, phylogenetische Bäume hochzuladen und sie mit Metadaten, funktionalen Genen oder taxonomischen Klassifikationen zu annotieren. Es ist beliebt für die Darstellung evolutionärer Beziehungen mit klaren, geschichteten Grafiken.
• ImageGP: Entwickelt von Yong-Xin Lius Team, unterstützt ImageGP fortgeschrittene Visualisierungen wie Balkendiagramme, Streudiagramme und Heatmaps. Es ist nützlich für den Vergleich von Häufigkeitsverteilungen über Probengruppen hinweg.

Präsentation ist wichtig: Gestalte wie ein Journal-Redakteur

Die Präsentationsqualität ist entscheidend, wenn Sie Abbildungen für die Veröffentlichung vorbereiten, insbesondere in hochrangigen Fachzeitschriften wie Nature Ecology & Evolution. Behalten Sie diese bewährten Praktiken im Hinterkopf:

• Verwenden Sie vektorbasierte Formate (z. B. SVG oder PDF) für scharfe Grafiken.
• Wählen Sie farbenblinde-freundliche Paletten aus, um die Barrierefreiheit zu verbessern.
• Stellen Sie sicher, dass alle Achsen, Legenden und Gruppierungen klar beschriftet sind.
• Halten Sie eine hohe Auflösung (300 dpi+) für Druck- und digitale Ausgaben ein.

Kurz gesagt, ein gut gestaltetes Diagramm sieht nicht nur gut aus – es vermittelt die Geschichte hinter Ihren Daten.

Statistische Analyse-Rahmenwerke

Identifizierung bedeutungsvoller Unterschiede zwischen mikrobiellen Gruppen

Sobald mikrobielle Gemeinschaften profiliert und visualisiert sind, besteht der nächste Schritt darin, zu bestimmen, welche Taxa tatsächlich zwischen den Gruppen unterschiedlich sind. Hier kommen statistische Analyseframeworks ins Spiel, die den Forschern helfen, von der Beobachtung zu biologischen Erkenntnissen zu gelangen.

Drei weit verbreitete Werkzeuge in der Analyse von Amplicon-Sequenzierungen sind:

• LEfSe (Lineare Diskriminanzanalyse Effektgröße): LEfSe identifiziert unterschiedlich abundant Taxa, indem es den Kruskal-Wallis-Test mit der linearen Diskriminanzanalyse (LDA) kombiniert. Zunächst werden statistisch signifikante Merkmale erkannt und dann nach Effektgröße eingestuft, um hervorzuheben, welche mikrobiellen Gruppen am stärksten mit jeder Bedingung assoziiert sind.
• ANCOM (Analyse der Zusammensetzung von Mikrobiomen): Im Gegensatz zu traditionellen Methoden, die kompositionale Verzerrungen ignorieren, berücksichtigt ANCOM die relative Natur von mikrobiellen Abundanzdaten. Es ist besonders nützlich für Datensätze mit Nullinflation (viele Nullen) und seltenen Taxa, was es zu einer robusten Wahl für klinische oder umweltbezogene Vergleiche macht.
• PERMANOVA (Permutationsbasierte Multivariate Varianzanalyse): PERMANOVA bewertet, ob die Gesamtstruktur der Gemeinschaften zwischen Gruppen unterschiedlich ist, basierend auf einer Distanzmatrix. Es ist nicht-parametrisch und ideal für mikrobielle Daten, die häufig die Annahmen der Normalverteilung verletzen.

Zusammen bilden diese Werkzeuge ein leistungsstarkes Toolkit zur Entdeckung bedeutungsvoller biologischer Unterschiede – nicht nur statistischer Rauschen.

Fallstudie: Verknüpfung von Mikrobiomverschiebungen mit Krankheiten

Eine Studie von Wu et al. (2022) untersuchte die Auswirkungen von Metformin auf die Darmmikrobiota in einem Mausmodell für durch eine fettreiche Ernährung induzierte Glykolipidstoffwechselstörungen. Mithilfe von LEfSe-, ANCOM- und PERMANOVA-Analysen identifizierten die Forscher signifikante Veränderungen in der mikrobielle Zusammensetzung und Funktion, die mit der Metformin-Behandlung verbunden waren. Diese Ergebnisse unterstreichen den Nutzen umfassender statistischer Rahmenbedingungen zur Aufdeckung mikrobieller Taxa, die mit therapeutischen Interventionen verknüpft sind.

Fazit und bewährte Praktiken

Erstellung reproduzierbarer Amplicon-Sequenzierungs-Pipelines

In mikrobiellen Sequenzierungsprojekten ist Reproduzierbarkeit nicht optional – sie ist essenziell. Ob in der Wissenschaft oder zur Unterstützung einer klinischen Pipeline, die Gewährleistung, dass andere Ihre Ergebnisse reproduzieren können, schafft Vertrauen und wissenschaftliche Glaubwürdigkeit.

Zwei Plattformen, die häufig für reproduzierbare Analysen verwendet werden, sind QIIME2 und Mothur. Beide bieten standardisierte Workflows – aber Reproduzierbarkeit hängt von mehr ab als nur der Wahl des Werkzeugs. Es erfordert:

• Versionsverfolgung: Immer die genaue verwendete Softwareversion aufzeichnen. In QIIME2 die Version in Ihren Skripthauptüberschriften oder Dokumentationen einfügen.
• Umgebungsisolierung: Verwenden Sie Conda-Umgebungen zur Verwaltung von Abhängigkeiten. Dies vermeidet Konflikte und gewährleistet konsistente Ergebnisse, selbst Monate oder Jahre später.

In einer aktuellen Studie, die in iMeta veröffentlicht wurde, zeigten Forscher den Wert dieser Praktiken. Durch die Kombination von strenger Versionskontrolle mit Conda-basiertem Umweltmanagement in QIIME2 gelang es ihnen, ihre Analyse der mikrobiellen Gemeinschaft über unabhängige Durchläufe hinweg erfolgreich zu reproduzieren - ein Modell für bewährte Praktiken in der Omics-Forschung.

Vermeidung häufiger Fallstricke bei der Amplicon-Analyse

Selbst mit den richtigen Werkzeugen kann die Amplicon-Sequenzierung irreführende Ergebnisse liefern, wenn bestimmte Fallen nicht vermieden werden. Hier sind drei Schlüsselbereiche, in denen häufig Fehler auftreten – und wie man sie verhindern kann:

• Primärselektion Bias
• Schlechtes Primerdesign kann die Ergebnisse verzerren, indem es einige Taxa amplifiziert und andere verpasst. Um dies zu vermeiden:
• Verwenden Sie degenerierte Primer, um die Zielinklusion zu erhöhen.
• Validieren Sie mehrere Primer-Sets, bevor Sie großangelegte Durchläufe durchführen.
• Datenbankinkonsistenzen
• Taxonomische Klassifikationen können je nach Datenbankversion variieren. Für eine genaue Zuordnung:
• Verwenden Sie die neueste Version Ihrer gewählten Datenbank (z. B. Silva, RDP).
• Dokumentieren Sie klar die verwendete Version in allen Berichten und Veröffentlichungen.
• Vermeiden Sie veraltete Ressourcen - Greengenes wurde seit 2013 nicht mehr aktualisiert.
• Unangemessene Diversitätskennzahlen
• Nicht alle Diversitätsindizes sind gleich. Wählen Sie basierend auf Ihrem Forschungsziel:
• Der Shannon-Index spiegelt sowohl die Artenvielfalt als auch die Gleichmäßigkeit wider und ist geeignet für allgemeine Vergleiche.
• Faiths phylogenetische Diversität (PD) berücksichtigt evolutionäre Beziehungen - ideal, wenn Phylogenie von Bedeutung ist.

Durch proaktives Management dieser Probleme können Forscher die Zuverlässigkeit, Genauigkeit und Interpretierbarkeit ihrer mikrobiellen Gemeinschaftsdaten erheblich steigern.

Referenzen:

1. Wastyk HC, Fragiadakis GK, Perelman D, et al. Auf den Darmmikrobiota ausgerichtete Diäten modulieren den menschlichen Immunstatus. Cell. 2021;184(16):4137-4153.e14. DOI: 10.1016/j.cell.2021.06.019
2. Zhang, J., Liu, Y., Zhang, X., et al. (2019). Ansätze zur quantitativen Bestimmung von Bodenbakterien in Verbindung mit relativen Häufigkeiten, die die Veränderungen von Taxa widerspiegeln. Scientific Reports, 9, 11076. Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von externen Links oder spezifischen Artikeln übersetzen. Wenn Sie mir den Text geben, den Sie übersetzt haben möchten, helfe ich Ihnen gerne dabei.
3. Ye, L., Zhang, T., Wang, T. T., & Fang, Z. W. (2012). Mikrobielle Strukturen, Funktionen und Stoffwechselwege in Abwasserbehandlungs-Bioreaktoren, aufgedeckt durch Hochdurchsatz-Sequenzierung. Umweltwissenschaften & Technologie, 46(24), 13244-13252. DOI: 10.1021/es303454k
4. Wu, H., Wang, X., Fang, X., et al. (2022). Metformin moduliert das Mikrobiom des Darms in einem Mausmodell für durch eine fettreiche Diät induzierte Störungen des Glykolipidstoffwechsels. Frontiers in der Mikrobiologie, 13, 1001234. Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von externen Links übersetzen. Wenn Sie einen bestimmten Text oder Abschnitt haben, den Sie übersetzt haben möchten, können Sie ihn hier einfügen, und ich helfe Ihnen gerne dabei.