18S rRNA Metatranskriptomik: Prinzipien, Anwendungen und Herausforderungen

18S rRNA-Metatranskriptomforschung konzentriert sich auf transkriptomische Informationen, die sich um die 18S rRNA-Gen Transkripte von eukaryotischen Mikroorganismen. Durch die Nutzung von Hochdurchsatz-Sequenzierung Technologie, sie erfasst alle 18S rRNA und verwandte Transkripte von eukaryotischen Mikroorganismen in spezifischen Umwelt- oder biologischen Proben und offenbart die Zusammensetzung aktiver Mikroorganismen, deren funktionale Expression und Mechanismen der Umweltanpassung. Dieser Artikel beschäftigt sich mit der 18S rRNA Metatranskriptomik, analysiert ihre Kerntechnologien, Prinzipien und die synergistischen Effekte von 18S und MetatranskriptomikEs beschreibt die experimentellen Grundlagen, Datenanalyse-Workflows, veranschaulicht die biologische Bedeutung durch typische Fallstudien und untersucht technische Herausforderungen, Lösungen und zukünftige Richtungen, und bietet einen technischen Leitfaden für die Forschung an eukaryotischen Mikroorganismen.

Was ist 18S rRNA Metatranskriptomik?

Als aufstrebende und vielversprechende Technik hinterlässt die 18S rRNA Metatranskriptomik allmählich ihren Eindruck im Bereich der Mikrobiologieforschung. Sie kombiniert geschickt die Stärken der 18S rRNA Sequenzierung und der Metatranskriptomik und bietet eine neue Perspektive, um tiefer in die Geheimnisse eukaryotischer Mikroorganismen einzutauchen.

Prinzipien der 18S rRNA Metatranskriptomik

18S rRNA-Sequenzierung zielt auf die ribosomalen RNA-Gene eukaryotischer Mikroorganismen ab. Durch die Sequenzierungsanalyse dieses spezifischen Bereichs kann eine genaue Artenklassifikation und Abundanzbewertung erreicht werden. Diese Technologie ähnelt der Erstellung einer "Identitätskarte" für eukaryotische Mikroorganismen, die es uns ermöglicht, die Arten von eukaryotischen Mikroorganismen in einer Probe und ihre relativen Mengen zu identifizieren. Metatranskriptomik hingegen konzentriert sich auf alle RNAs in einem aktiven Transkriptionszustand innerhalb von Umweltproben. Sie spiegelt direkt die aktuellen metabolischen Aktivitäten von Mikroorganismen wider und fungiert wie eine "Echtzeitkamera", die die physiologischen Zustände und funktionalen Aktivitäten von Mikroorganismen zu bestimmten Zeitpunkten erfasst. Zum Beispiel kann die 18S rRNA-Sequenzierung beim Studium mariner Mikrobengemeinschaften uns über das Vorhandensein von Algen und Pilzen in der Probe informieren, während die Metatranskriptomik die Photosynthese, Stoffsynthese und andere Stoffwechselprozesse aufdecken kann, die diese Mikroorganismen durchlaufen.

Vorteile der technologischen Integration

Die Integration von 18S rRNA und Metatranskriptomik erzielt einen "1+1>2"-Effekt. Sie beantwortet nicht nur die grundlegende Frage "Wer sind die eukaryotischen Mikroorganismen?", sondern geht auch weiter auf die entscheidende Frage "Was machen sie?" ein. Diese Fähigkeit zur doppelten Antwort ist besonders ausgeprägt in der Untersuchung komplexer Umweltproben. Nehmen wir zum Beispiel Bodenproben, die eine reiche Vielfalt an Pilzen und Algen mit komplexen Wechselwirkungen enthalten. Durch 18S rRNA Metatranskriptomik können wir die Artenzusammensetzung dieser Mikroorganismen umfassend verstehen und ihre spezifischen Rollen sowie Wechselbeziehungen in Prozessen wie Materialkreisläufen und Energieflüssen näher untersuchen. Relevante Studien haben gezeigt, dass in Waldböden bestimmte Pilze und Algen durch symbiotische Beziehungen an der Kohlenstofffixierung teilnehmen, eine Entdeckung, die durch die umfassende Anwendung dieser Technologie möglich wurde.

Datenanalyse-Workflow für 18S rRNA Metatranskriptomik

Datenanalyse dient als die entscheidende Brücke, die rohe Sequenzierungsdaten in wertvolle biologische Erkenntnisse umwandelt und eine Reihe von spezialisierten Werkzeugen und Methoden erfordert.

Toolchain-Integration

• QualitätskontrolleZu Beginn der Datenanalyse hat die Qualitätskontrolle Vorrang. Die Verwendung der FastQC-Software für eine umfassende Untersuchung der Rohsequenzierungsdaten ermöglicht eine schnelle Identifizierung von Sequenzen niedriger Qualität, Adaptersequenzen und potenziellen Kontaminanten. Anschließend wird die Trimmomatic-Software eingesetzt, um diese Sequenzen niedriger Qualität zu entfernen und die Integrität der Daten für die nachfolgende Analyse sicherzustellen. In einer Studie zu mikrobiellen Proben aus Seen entfernten Qualitätskontrollmaßnahmen beispielsweise etwa 15 % der Sequenzen niedriger Qualität, was die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Daten erheblich verbesserte.
• 18S-AnalyseFür 18S-Sequenzierungsdaten wird das DADA2-Plugin innerhalb von QIIME2 zur Identifizierung von Amplicon-Sequenzvarianten (ASV) verwendet. Die ASV-Identifizierung bietet eine überlegene Präzision bei der Unterscheidung mikrobieller Sequenzen und erhöht die Auflösung der Artenklassifikation. Im Vergleich zu traditionellen Methoden der Operational Taxonomic Units (OTU) deckt die ASV-Identifizierung nuanciertere Artenunterschiede auf und liefert detaillierte Einblicke für eine umfassende Forschung zur mikrobiellen Vielfalt. Studien bestätigen, dass bei der Forschung zur Diversität von Bodenpilzen die ASV-Identifizierung über 20 % mehr Arten erkennt als OTU-Methoden.
• Transkriptom-AnalyseWährend der Transkriptomanalyse besteht der erste Schritt darin, Sequenzierungsdaten mit der HISAT2-Software an ein Referenzgenom auszurichten, um das Quellgen für jeden Read zu bestimmen. Anschließend assembliert die Software StringTie Transkripte und erstellt eine umfassende Transkriptomkarte. Dieser Prozess identifiziert genau die exprimierten Gene und deren Transkriptionsniveaus in der Probe und legt die Grundlage für nachfolgende funktionale Analysen. Zum Beispiel identifizierte dieser Analyse-Workflow in einer transkriptomischen Studie über pflanzliche endophytische Pilze erfolgreich mehrere Schlüsselgene, die an pflanzen-pilzlichen Wechselwirkungen beteiligt sind.
• Funktionale AnnotationDie Kombination von eggNOG-mapper mit der KEGG-Datenbank zur funktionalen Annotation von Transkripten ist ein entscheidender Schritt zur Aufklärung mikrobieller Stoffwechselwege. eggNOG-mapper ordnet Gensequenzen schnell bekannten Funktionskategorien zu, während die KEGG-Datenbank eine Fülle von Informationen über Stoffwechselwege bietet. Durch die Integration dieser Ressourcen gewinnen wir ein ganzheitliches Verständnis der mikrobiellen Genfunktionen und ihrer Rollen innerhalb von Stoffwechselnetzwerken. In einer Studie über intestinale Pilze enthüllte die funktionale Annotation kritische Stoffwechselwege, die mit der Nährstoffaufnahme des Wirts und der Immunregulation verbunden sind.

Datenanalysetool für 18S rRNA Metatranskriptomik

Innovative analytische Ansätze

• Korrelation Netzwerk KonstruktionDie Anwendung des SparCC-Algorithmus zur Konstruktion von Korrelationsnetzwerken zwischen mikrobiellen Taxa und der Expression funktioneller Gene ermöglicht eine eingehende Untersuchung der Interaktionen innerhalb mikrobieller Gemeinschaften. Diese Methode identifiziert synergistische oder antagonistische Beziehungen zwischen verschiedenen mikrobiellen Arten sowie zwischen mikrobiellen funktionellen Genen und bietet neue Perspektiven für das Verständnis der Struktur und Funktion mikrobieller Gemeinschaften. Zum Beispiel zeigte eine Studie über Bodenmikroben-Gemeinschaften, dass die Konstruktion von Korrelationsnetzwerken enge symbiotische Beziehungen zwischen bestimmten Pilzen und Bakterien aufdeckte, die gemeinsam an der Zersetzung von organischer Bodenmasse beteiligt waren.
• ZeitreihenanalyseDie Zeitreihenanalyse verfolgt die dynamischen Reaktionen eukaryotischer Mikrobengemeinschaften auf Umweltveränderungen. Durch die Analyse von Proben, die zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen wurden, können wir die Muster des Wandels und die Anpassungsmechanismen von Mikrobengemeinschaften verstehen, wenn sie mit Umweltstörungen konfrontiert werden. Zum Beispiel zeigte eine Studie zu Mikrobengemeinschaften während des Eutrophierungsprozesses von Gewässern, dass die Zeitreihenanalyse die relativen Häufigkeitsänderungen verschiedener Mikrobengruppen in verschiedenen Phasen sowie ihre dynamischen Beziehungen zu Umweltfaktoren aufdeckte.

Anwendungen der 18S rRNA Metatranskriptomik

Die 18S rRNA-Metatranskriptomik-Technologie hat einen erheblichen Anwendungswert in verschiedenen biologischen Bereichen gezeigt, wie die folgenden typischen Fallstudien veranschaulichen.

Fallstudie 1: 18S Metatranskriptomik für eukaryotische Gemeinschafts- und Expressionsprofilierung

Terrón-Camero und Kollegen nutzten diese Technologie, um eine 18S-Analyse-Pipeline zu entwickeln, die auf Kraken2 + Bracken basiert. Sie testeten diese rigoros mit sowohl simulierten als auch realen Datensätzen, die eukaryotische Mikroorganismen wie Pilze und Protisten umfassten. Ihr Workflow beinhaltete eine erste Filterung mit SortMeRNA, um Wirts- und niedrigqualitative Reads zu eliminieren, gefolgt von der k-mer-Klassifizierung der 18S-Reads mit Kraken2. Schließlich verfeinerte Bracken die Schätzungen der Artenhäufigkeit durch einen bayesianischen Algorithmus.

Die Ergebnisse waren bemerkenswert und zeigten eine signifikant höhere Klassifikationsgenauigkeit auf Artenebene (Pearson r = 0,82) im Vergleich zu QIIME2 (r = 0,67) sowie eine erstaunliche 344-fache Beschleunigung der Rechengeschwindigkeit. Darüber hinaus übertraf dieser Ansatz traditionelle Methoden zur alignierten Analyse von Leseeinheiten in der Identifizierung von eukaryotischen Arten mit geringer Häufigkeit mit größerer Sensitivität. Für Forscher, die die "aktive" eukaryotische Mikrobiota und ihr Genexpressionsprofil erfassen möchten, hebt sich die 18S rRNA Metatranskriptomik in Verbindung mit der Kraken2/Bracken-Pipeline als die bevorzugte Wahl hervor, da sie eine effiziente und reproduzierbare Quantifizierung von Arten sowie eine funktionale Annotation gewährleistet.

Nutzung von 18S rRNA-Metatranskriptomik zur Identifizierung eukaryotischer Mikrobengemeinschaften und zur Profilerstellung ihrer Genexpression (Terrón-Camero et al., 2022)

Fallstudie 2: 18S rRNA-Metatranskriptomik für Identifizierung von mikrobiellen Arten

Xie und Kollegen konzentrierten ihre Studie auf Roh- Metagenomik/metatranskriptomische Reads, die aus komplexen mikrobiellen Gemeinschaften stammen, wie sie in aktivierten Schlämmen, im Darm und im Boden vorkommen. Sie verwendeten eine 18S rRNA-Metatranskriptomik-Strategie mit einem einzigartigen Ansatz: Anstatt auf PCR-Amplifikation zu setzen, extrahierten sie direkt 18S rRNA-Reads aus dem V4-V7-Bereich innerhalb der Shotgun-Daten. Dies wurde unter Verwendung einer 23-nt konservierten Erkennungssequenz (RS) und einem 33-nt variablen Tag (TS) erreicht, was es ihnen ermöglichte, Aktivitätsinformationen von eukaryotischen Mikroorganismen zu erfassen.

Ihre Ergebnisse waren beeindruckend. Das RiboTagger-Tool, das sie verwendeten, konnte in nur 1,5 Stunden 40 Millionen Reads verarbeiten und wies sowohl eine Sensitivität als auch eine Spezifität von über 95 % auf. Aus metatranskriptomischen Proben, die von einer Abwasserbehandlungsanlage in Singapur entnommen wurden, konnten sie erfolgreich 4.867 verschiedene 18S V4-Tags zurückgewinnen. Dies ermöglichte eine präzise Unterscheidung zwischen eukaryotischen Gruppen, einschließlich Pilzen und Protisten. Im Wesentlichen bietet diese Forschung eine effiziente, unvoreingenommene Methode zur schnellen Analyse aktiver eukaryotischer Mikroorganismen in komplexen Ökosystemen und stellt ein wertvolles Werkzeug für Fachleute in den Bereichen Umweltüberwachung, Biotechnologie und pharmazeutische Forschung dar.

Identifizierung vielfältiger mikrobieller Arten durch 18S rRNA-Metatranskriptomik (Xie et al., 2016)

Technische Herausforderungen und Lösungen

Obwohl die 18S rRNA-Metatranskriptomik enormes Potenzial birgt, stehen ihrer praktischen Anwendung dennoch bestimmte Hürden im Weg.

Aktuelle Engpässe

Derzeit sind öffentlich verfügbare Referenzgenome für eukaryotische Mikroorganismen begrenzt und decken weniger als 30 % ab. Dies stellt erhebliche Herausforderungen für die Artenklassifikation und funktionale Annotation dar. Aufgrund der Knappheit an Referenzsequenzen kann ein großer Teil der Sequenzierungsdaten nicht genau mit bekannten Genomen abgeglichen werden, was zu einer großen Anzahl unbekannter Sequenzen führt. Zum Beispiel macht in der Forschung zu seltenen Pilzen das Fehlen entsprechender Referenzgenome in Datenbanken eine Bestimmung ihrer Artenklassifikation und funktionalen Eigenschaften unmöglich, was tiefere Studien behindert.

Darüber hinaus ist RNA in Umweltsamples äußerst anfällig für eine schnelle Zersetzung durch RNase, was RNA-Zersetzung während der Probenentnahme, -konservierung und -transport zu einem großen Problem macht. RNA-Zersetzung führt zu einem Rückgang der Qualität der Sequenzierungsdaten, was die nachfolgenden Analyseergebnisse beeinträchtigt. Wenn beispielsweise Wasserproben nicht umgehend bei niedrigen Temperaturen gelagert und schnell nach der Entnahme verarbeitet werden, tritt innerhalb kurzer Zeit eine merkliche RNA-Zersetzung auf, was zum Verlust wertvoller Informationen in den Sequenzierungsdaten führt.

Lösungen

Um das Problem der Datenbankknappheit zu lösen, ist die Hybridfängertechnologie entstanden. Durch das Design spezifischer Sonden kann diese Technologie die RNA von Ziel-eukaryotischen Mikroorganismen anreichern und den Anteil der Zielsequenzen in Sequenzierungsdaten erhöhen. Dieser Ansatz kann teilweise die Mängel der Datenbank ausgleichen und Forschern helfen, neue mikrobielle Arten und funktionale Gene zu entdecken. Zum Beispiel hat die Hybridfängertechnologie bei der Untersuchung von Pilzen in extremen Umweltproben erfolgreich die RNA einiger seltener Pilze angereichert und Möglichkeiten für eine eingehende Forschung zu ihren biologischen Eigenschaften geschaffen.

Darüber hinaus bietet das Aufkommen von KI-Vorhersagetools wie AlphaFold3 eine neue Möglichkeit, das Problem unbekannter funktioneller Gene anzugehen. Diese Tools können die Proteinstrukturen vorhersagen, die durch Gensequenzen kodiert sind, und somit die Proteinfunktionen ableiten. Durch die Vorhersage der Proteinstrukturen unbekannter funktioneller Gene und die Kombination dieser Informationen mit bestehendem biologischen Wissen können Forscher erste Einblicke in die Stoffwechselwege und biologischen Prozesse gewinnen, an denen diese Gene beteiligt sein könnten. Zum Beispiel wurde in der genomischen Forschung zu Bodenpilzen AlphaFold3 verwendet, um die Proteinstrukturen einiger unbekannter funktioneller Gene vorherzusagen, was offenbarte, dass einige dieser Proteine möglicherweise mit der Antibiotika-Synthese in Verbindung stehen, was Hinweise für weitere Untersuchungen von bioaktiven Substanzen aus Pilzen liefert.

Fazit

Als aufkommende interdisziplinäre Technologie bietet die 18S rRNA Metatranskriptomik sowohl neue Möglichkeiten als auch Herausforderungen für die Forschung zu eukaryotischen Mikroorganismen. Durch die geschickte Kombination der Stärken der 18S rRNA-Sequenzierung und der Metatranskriptomik ermöglicht diese Technologie eine umfassende und tiefgehende Untersuchung der Artenzusammensetzung und der metabolischen Aktivitäten eukaryotischer Mikroben.

Mit Blick auf die Zukunft wird die kontinuierliche technologische Integration und intelligente Fortschritte dazu führen, dass die 18S rRNA Metatranskriptomik eine zunehmend wichtige Rolle in verschiedenen Bereichen spielt, einschließlich Meeresökologie, Agrarböden und menschlicher Gesundheit. Sie wird eine solide Unterstützung bieten, um bedeutende biologische Fragen zu beantworten und den wissenschaftlichen Fortschritt voranzutreiben.

Referenzen:

1. Terrón-Camero LC, Gordillo-González F, Salas-Espejo E, et al. "Vergleich von Metagenomik- und Metatranskriptomik-Tools: Ein Leitfaden zur richtigen Wahl." Gene. 2022;13(12):2280. Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von externen Links übersetzen. Bitte geben Sie den Text ein, den Sie übersetzt haben möchten..
2. Xie C, Goi CLW, Huson DH, et al. "RiboTagger: schnelles und unvoreingenommenes 16S/18S-Profiling mittels ganzheitlicher Community-Shotgun-Metagenomik oder Metatranskriptom-Umfragen." BMC Bioinformatik2016;17(Suppl 19):508. Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von externen Links übersetzen. Bitte geben Sie den Text ein, den Sie übersetzt haben möchten..