Genetische Verknüpfungsanalyse: Definition, Techniken und Anwendungen

Einführung in die genetische Verknüpfung und Verknüpfungskarte

DNA-Sequenzen, die auf einem Chromosom nahe beieinander liegen, neigen dazu, während der Meiose-Phase der sexuellen Fortpflanzung gemeinsam weitergegeben zu werden. Wenn zwei genetische Marker physisch nahe beieinander liegen, ist es weniger wahrscheinlich, dass sie während des chromosomalen Crossing-Over auf verschiedene Chromatiden getrennt werden, und sie gelten daher als stärker verknüpft als Marker, die weit auseinander liegen. Mit anderen Worten, je näher zwei Gene auf einem Chromosom beieinander liegen, desto unwahrscheinlicher ist es, dass sie rekombinieren, und desto wahrscheinlicher werden sie gemeinsam vererbt. Verschiedene Chromosomenmarker sind völlig unabhängig.

Ein genetische Verknüpfungskarte beschreibt die Position der bekannten Gene oder genetischen Marker einer Art oder experimentellen Population in Bezug auf die Rekombinationsfrequenz anstelle einer bestimmten physischen Distanz entlang jedes Chromosoms. Eine Kopplungskarte ist ein Diagramm, das zeigt, wie häufig Marker während des homologen Chromosomen-Crossovers rekombinieren. Je mehr Rekombination (Segregation) zwischen zwei genetischen Markern auftritt, desto weiter entfernt werden sie angenommen. Umgekehrt gilt: Je geringer die physische Distanz zwischen den Markern, desto geringer ist die Rekombinationsfrequenz zwischen ihnen. Zuvor wurden unterscheidbare Phänotypen (Enzymproduktion, Augenfarbe), die aus kodierenden DNA-Sequenzen abgeleitet wurden, als Marker verwendet; schließlich wurden nicht-kodierende DNA-Sequenzen wie Mikrosatelliten oder diejenigen, die Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLPs) erzeugen, wurden verwendet.

Forscher können Kopplungskarten verwenden, um andere Marker, wie Gene, zu finden, indem sie genetische Kopplung zwischen zuvor identifizierten Markern testen. Die Daten werden verwendet, um Kopplungsgruppen zusammenzustellen, die Gruppen von Genen sind, von denen bekannt ist, dass sie gekoppelt sind, in den frühen Phasen der Entwicklung einer Kopplungskarte. Weitere Marker können in eine Gruppe integriert werden, während das Wissen fortschreitet, bis die Gruppe ein ganzes Chromosom umfasst.

Rekombinationsfrequenz

Die Rekombinationsfrequenz dient als Maß für die genetische Verknüpfung und wird bei der Erstellung genetischer Verknüpfungskarten verwendet. Gene, die nicht vollständig verknüpft sind, unterliegen zwangsläufig Rekombinationen aufgrund des Austauschs homologer chromosomaler Segmente während der Meiose. Dies führt zur Entstehung von Rekombinanten oder Nachkommen, die durch eine neue Kombination von Merkmalen gekennzeichnet sind. Diese Rekombinanten stellen einen bestimmten Anteil der gesamten Nachkommenschaft dar, der als Rekombinationswert, Prozentsatz der Rekombination oder Rekombinationsfrequenz dargestellt wird.

Diese Maßnahme, ausgedrückt als Prozentsatz der Rekombinanten in der gesamten Nachkommenschaft, beschreibt die Wahrscheinlichkeit von Crossing-over-Ereignissen zwischen bestimmten verknüpften genetischen Markern. Ein solcher Maßstab kann auch als Centimorgan (cM) bezeichnet werden, die Einheit, die eine Rekombinationshäufigkeit von 1 % veranschaulicht.

Diese Rekombinationsinformationen bieten ein indirektes, aber kraftvolles Mittel, um die genetische Distanz zwischen zwei Loci zu quantifizieren. Durch die Untersuchung ihrer Rekombinationsfrequenz können Wissenschaftler Rückschlüsse auf ihre relativen Positionen auf dem Chromosom ziehen, was zu unserem Verständnis der Genomarchitekturen und evolutionären Dynamiken beiträgt.

Faktoren, die die Rekombinationsfrequenz beeinflussen: Genabstand und -position, Übertragungsrate und Lebensfähigkeit der Gameten, chromosomale Strukturvariationen, Hormonspiegel, Temperatur und Strahlung, Ionenkonzentration, externe Faktoren wie Alter usw.

Schlüsselpunkte:

• Gene, die sich entweder auf verschiedenen Chromosomen oder in beträchtlichen Abständen auf demselben Chromosom befinden, assortieren unabhängig voneinander und gelten als nicht gekoppelt.
• Wenn Gene in enger Nähe auf demselben Chromosom liegen, sagt man, dass sie gekoppelt sind, was darauf hinweist, dass Allele oder Genvarianten, die bereits auf einem Chromosom vorhanden sind, mit höherer Wahrscheinlichkeit gemeinsam als Einheit vererbt werden.
• Durch die Nutzung der Daten, die aus genetischem Crossing-over gewonnen wurden, um Rekombinationsfrequenzen zu berechnen, können wir Einblicke gewinnen, ob zwei Gene miteinander verwandt sind und die Stärke ihrer Verknüpfung bestimmen.
• Durch die Untersuchung der Rekombinationsfrequenzen zahlreicher Genpaare können wir eine Kopplungslandkarte erstellen, die die Reihenfolge und relativen Abstände der Gene auf einem Chromosom zeigt.

Abbildung 1. (a) Physikalische und (b, c) genetische Verknüpfungskarten. (Chao, 2015)

Unterschied zwischen genetischer Karte und physikalischer Karte

Eine genetische Karte einer Art zeigt die relativen Positionen bekannter Gene und/oder genetischer Marker auf dem Chromosom, nicht deren einzigartigen physischen Standorte auf jedem Chromosom. Mithilfe genetischer Analysemethoden wie Hybridisierungsexperimenten und familiärer Linienanalyse werden Gene oder andere DNA-Marker auf dem Chromosom angeordnet. Der Abstand zwischen den Markern, oder die genetische Kartendistanz, wird durch die Häufigkeit von Crossing-over-Ereignissen während der Meiose dargestellt, dies wird in Centimorgans (cM) gemessen, wobei jede Einheit eine Austauschrate von 1 % definiert. Die Auflösung einer genetischen Karte ist etwas grob und erreicht ungefähr ein Niveau von einer Million Basenpaaren (1 Mb).

Eine physische Karte zeigt im Wesentlichen den physischen Standort identifizierbarer Marker (wie z.B. Schnittstellen von Restriktionsenzymen oder Gene) auf der DNA. Der Kartenabstand ist die physische Längeneinheit, wie z.B. das Chromosomenband oder die Anzahl der Nukleotidpaare.

Vergleich der beiden:

• Eine genetische Karte basiert auf Rekombinationsfrequenzen, während eine physische Karte auf direkt gemessenen DNA-Struktureigenschaften basiert.
• Die Häufigkeit der meiotischen Rekombination ist ungleichmäßig entlang der meisten Chromosomen verteilt, mit Bereichen von Hotspot- und Coldspot-Rekombination und/oder Mutation.
• Eine genetische Karte zeigt die relative Distanz zwischen Genen oder Markern an, dargestellt durch den Rekombinationswert und gemessen in cM.
• Eine physische Karte hebt die physische Distanz zwischen Genen oder Markern hervor, die Distanz Einheit ist eine Längeneinheit, wie Mikrometer (μm) oder Basenpaarzahlen (bp oder kp).

Techniken zur genetischen Verknüpfungsanalyse

Die Technologie der genetischen Verknüpfungsanalyse umfasst hauptsächlich zwei Aspekte: die Erkennung und Analyse genetischer Marker sowie den Aufbau und die Darstellung von Verknüpfungskarten. In Bezug auf die Erkennung genetischer Marker bieten moderne biologische Techniken wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Sequenzierungstechnologien hochdurchsatzfähige, hochauflösende Ansätze; diese können schnell und präzise eine Vielzahl genetischer Marker identifizieren. Im Gegensatz dazu umfassen gängige Techniken beim Aufbau von Verknüpfungskorrelationen die genetische Verknüpfungsanalyse und die Genotyp-Phänotyp-Korrelationsanalyse.

Technologien basierend auf Molekulare Marker:

Molekulare Marker kann gemäß ihrer technischen Eigenschaften in vier Typen kategorisiert werden: DNA-Markierungstechniken, die auf molekularer Hybridisierung basieren, wie Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLP); DNA-Markierungstechniken, die auf PCR basieren, wie einfache Sequenzwiederholungen (SSR); DNA-Markierungstechniken, die PCR mit Restriktionsenzym-Schnitt kombinieren, wie amplifizierte Fragmentlängenpolymorphismen (AFLP); und DNA-Markierungstechniken, die auf Einzelne Nukleotidpolymorphismen (SNP) verankert sind.

RFLP: RFLP identifiziert DNA-Polymorphismen, indem DNA mit Restriktionsendonukleasen geschnitten und anschließend durch Methoden wie Gel-Elektrophorese unterschiedlich lange DNA-Fragmente nachgewiesen werden.

AFLP: AFLP integriert die Verwendung von Restriktionsendonukleasen und PCR, um polymorphe Fragmente innerhalb der DNA effizient nachzuweisen, und wird häufig in der genetischen Verknüpfungsanalyse und genetischen Kartierung eingesetzt.

SSR oder Mikrosatellit Marker: SSR besteht aus wiederholten Einheiten von kurzen DNA-Sequenzen. Ihre Längenvariation ist nützlich für die genetische Verknüpfungsanalyse. Mikrosatellit Marker hingegen setzen auf PCR-Amplifikation und Gel-Elektrophorese-Techniken, um Polymorphismen in SSR-Regionen nachzuweisen.

SNPs: SNPs können durch PCR, Sequenzierung usw. nachgewiesen werden und werden häufig in der genetischen Kopplungsanalyse und in genomweiten Assoziationsstudien angewendet.

Technologien zur Nutzung von Hochdurchsatz-Sequenzierung:

Genotypisierung durch Sequenzierung (GBS)GBS nutzt Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie, um Genome zu sequenzieren und genetische Verknüpfungsanalysen durch Beobachtung von DNA-Sequenzvariationen in jedem Individuum durchzuführen. Diese Technik eignet sich für die breit angelegte Genotypanalyse und den Aufbau genetischer Karten.

Whole Genome Sequencing (WGS) für die VerknüpfungsanalyseDurch die Sequenzierung des gesamten Genoms kann die WGS die chromosomalen Standorte genetischer Marker genau bestimmen und bietet einen hochauflösenden Ansatz zur genetischen Verknüpfungskartierung.

Fortgeschrittene rechnergestützte Methoden für Linkage-Mapping-Analysen:

Genetische Mapping-Software und Algorithmen: Dies umfasst hauptsächlich Software wie JoinMap, MapMaker und Algorithmen, einschließlich LOD-Analyse und Maximum-Likelihood-Methoden.

Integration von Verknüpfungsanalysen mit genomweiten Assoziationsstudien: Die Kombination von Verknüpfungsanalyse mit GWAS kann die Beziehungen zwischen Genen und Phänotypen präziser erkennen und neue genetische Varianten identifizieren, die mit spezifischen Phänotypen in Zusammenhang stehen.

Anwendungen der genetischen Verknüpfungsanalyse

Positionierung und Identifizierung von Genen und quantitativen Merkmalsloci (QTL): Durch die Analyse der genetischen Verknüpfungsbeziehungen können die chromosomalen Standorte von Genen, die spezifische Merkmale beeinflussen, bestimmt werden, was ihre Positionierung und Identifizierung ermöglicht. Dies enthüllt wesentliche Hinweise und Werkzeuge zum Verständnis der genetischen Grundlagen verschiedener Merkmale innerhalb von Organismen. Zu den klassischen Forschungsmethoden gehört das QTL-Mapping, ein Prozess, der die Gene identifiziert, die mit den Zielmerkmalen in Beziehung stehen, basierend auf der Verknüpfungsbeziehung zwischen molekularen Markern und den Zielmerkmalen. Genetisches Mapping wird typischerweise für Standortanalysen von Formvariationen zwischen zwei Eltern mit deutlich unterschiedlichen Merkmalen und Nachkommenpopulationen mit mehreren phänotypischen Merkmalen eingesetzt.

Abbildung 2. QTL-Kartierung in mehreren Umgebungen. (Fang et al., 2020)

Marker-gestützte Zucht: Durch die Analyse genetischer Marker, die mit den Zielmerkmalen in Zusammenhang stehen, können Züchter präziser Individuen mit den gewünschten Merkmalen für die Zucht auswählen, wodurch die Effizienz und Geschwindigkeit der selektiven Zucht erhöht wird. Diese Technik ermöglicht es Züchtern, Individuen mit wünschenswerten Merkmalen vorherzusagen und auszuwählen, ohne umfangreiche Labor- oder Feldversuche durchführen zu müssen, und stellt eine effektive Strategie zur Verbesserung der Qualität und des Ertrags von Nutzpflanzen dar. Basierend auf dem Aufbau einer genetischen Verknüpfungskarte kann die weitere Genpositionierung durch Marker-Seminierung und Phänotyp-Identifizierung erfolgen, wodurch das Zielgen ermittelt wird. Dies schafft eine solide Grundlage für die weitere Genklonierung und deren Anwendungen in der Zucht.

Die genetische Kartierung von Pflanzen wird in der Genomforschung, der Sortenverbesserung und der Genpositionierung weitreichend angewendet. Sie bietet ein wichtiges Werkzeug zum Verständnis der Struktur und genetischen Eigenschaften von Pflanzengenomen und liefert wertvolle Hinweise für Forscher, um die genetischen Grundlagen von Pflanzeneigenschaften zu erforschen und molekulare Züchtung durchzuführen. Bernard et al. verwendeten Techniken wie die genetische Kopplungskartierung, um die genetische Struktur phänologischer Eigenschaften und seitlichen Triebe bei der Persischen Walnuss (Juglans regia L.) zu untersuchen. Ihre Ergebnisse erweiterten unser Verständnis der genetischen Architektur, die wichtigen agronomischen Eigenschaften zugrunde liegt, die mit den männlichen und weiblichen Blühprozessen sowie dem seitlichen Trieb der Walnuss verbunden sind. Die Ergebnisse unterstrichen die Bedeutung des Keimdatums als eines der entscheidendsten Merkmale für wünschenswerte Ergebnisse und deuteten darauf hin, dass neuartige Marker bei der Auswahl und Entwicklung von Walnuss-Sorten, die an spezifische Klimata angepasst sind, hilfreich sein würden.

Vergleichende Kartierung und evolutionäre Studien: Durch den Vergleich der genetischen Verknüpfungskarten verschiedener Arten oder Populationen können ihre genetischen Beziehungen, evolutionären Geschichten und Populationsstrukturen aufgedeckt werden. Dies hilft Forschern, den Ursprung, die Evolution und die adaptiven Evolutionsprozesse von Arten zu verstehen und bietet wichtige Hinweise zum Schutz der biologischen Vielfalt sowie zur Erforschung der Mechanismen der Evolutionsbiologie.

Abbildung 3. SNP-Identifizierung und Konstruktion der genetischen Kartierung. (Fang et al., 2020)

Identifizierung genetischer Varianten, die mit Krankheiten bei Menschen und Modelltieren assoziiert sind: Durch die Analyse genetischer Verknüpfungskarten kann die chromosomale Position genetischer Varianten, die mit Krankheiten assoziiert sind, bestimmt werden, und ihr Einfluss auf den Krankheitsbeginn und die -entwicklung kann weiter untersucht werden. Dies bietet eine wichtige Grundlage für die frühe Krankheitsdiagnose, Risikobewertung und Behandlung und hat erhebliche Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit sowie die Prävention und Kontrolle von Krankheiten. Julier et al. führten eine Untersuchung der genetischen Karte des menschlichen Chromosoms 22 durch und erläuterten die Lokalisierung des P1-Polymorphismus der P-Blutgruppe auf Chromosom 22 (proximal zum SIS-Onkogen-Lokus) und lieferten damit zusätzliche Beweise.

Referenzen:

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