Einführung in DNA-Molekularmarker

Molekulare Marker stellen eine spezifische Kategorie innerhalb der breiteren Klassifikation genetischer Marker dar. Im allgemeinen Kontext umfassen genetische Marker Merkmale, die das Verfolgen der Vererbung verschiedener genetischer Eigenschaften ermöglichen, die auf einem Chromosom, einem bestimmten chromosomalen Segment oder einem spezifischen Genort innerhalb einer Familienlinie vorhanden sind. Genetische Marker sind durch zwei grundlegende Merkmale gekennzeichnet: Erblichkeit und die Fähigkeit, unterschieden zu werden. Im Wesentlichen kann jede genetische Mutation, die zu wahrnehmbaren Unterschieden im Phänotyp innerhalb eines bestimmten Organismus führt, die Rolle eines genetischen Markers erfüllen. Dies macht genetische Marker zu einem wichtigen Werkzeug in der genetischen Forschung und Analyse.

Was sind molekulare Marker?

Genetische Marker, die aus Variationen in Nukleotidsequenzen zwischen Individuen stammen, bieten eine direkte Darstellung von genetischem Polymorphismus auf DNA-Ebene. Sie dienen als direktes Mittel, um Einblicke in die Unterschiede im genomischen DNA verschiedener biologischer Individuen oder Populationen zu gewinnen. Dieses grundlegende Konzept unterstreicht ihre Bedeutung in der genetischen Forschung und Analyse.

Vorteile von molekularen Markern

1. Sie werden in DNA-Form präsentiert und sind nicht durch Faktoren wie Gewebe, Entwicklungsstadium, Jahreszeit oder Umwelt eingeschränkt. Sie leiden nicht unter Problemen im Zusammenhang mit der Expression oder deren Fehlen und zeigen Stabilität.
2. Sie sind zahlreich und über das gesamte Genom verteilt.
3. Sie zeigen ein hohes Maß an Polymorphismus, mit vielen bestehenden allelischen Variationen in der Natur.
4. Viele Marker zeigen eine co-dominante Natur, die eine Differenzierung zwischen homozygoten und heterozygoten Genotypen ermöglicht, was sie praktisch für die Auswahl rezessiver agronomischer Merkmale macht.
5. Sie haben einen neutralen Effekt, beeinflussen nicht die Ausprägung der Zielmerkmale und stehen in keinem Zusammenhang mit unerwünschten Eigenschaften.
6. Ihre Nachweismethoden sind einfach und schnell.

Vergleich von Co-dominanten und Dominanten Markern

Zwei wichtige Begriffe im Kontext von molekularen Markern sind dominante Marker und kodominante Marker. Einfach ausgedrückt werden molekulare Marker, die zwischen heterozygoten Genotypen unterscheiden können, als kodominante Marker betrachtet.

Anwendungen von molekularen Marker-Technologien

Bau von Genetische VerknüpfungskartenMolekulare Marker sind entscheidend für den Aufbau genetischer Verknüpfungskarten, die wertvolle Einblicke in die Lage und Reihenfolge von Genen auf Chromosomen bieten.

Gen-/QTL-Kartierung: Diese Marker spielen eine entscheidende Rolle bei der Lokalisierung von Genen und quantitativen Merkmal-Loci (QTLs) und unterstützen die Identifizierung genetischer Faktoren, die für spezifische Merkmale verantwortlich sind.

Molekulare Marker-gestützte Zucht: Molekulare Marker unterstützen die selektive Zucht, indem sie den gezielten Transfer gewünschter Eigenschaften von einem Organismus auf einen anderen ermöglichen und so die Effizienz von Zuchtprogrammen erhöhen.

Analyse der genetischen Vielfalt von Pflanzen: Molekulare Marker werden verwendet, um die genetische Vielfalt innerhalb von Pflanzenpopulationen zu bewerten und zu charakterisieren, was die Erhaltung und Nutzung genetischer Ressourcen unterstützt.

Vielfalt und Qualitätsreinheitsbewertung: Sie werden eingesetzt, um die genetische Reinheit und die Sortenidentität von Pflanzenmaterialien zu identifizieren und zu bestimmen, um die Integrität der Sorten zu gewährleisten.

Krankheitserkennung: Molekulare Marker werden zur Erkennung genetischer Marker eingesetzt, die mit Krankheiten assoziiert sind, und erleichtern die Diagnose und das Management von Krankheiten bei Pflanzen und Tieren.

Arten von molekularen Markern

Erste Generation - RFLP (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus)

Die Anwendung von RFLP-Markern der ersten Generation hat im Laufe der Zeit abgenommen. RFLP, was für Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus steht, beinhaltet die Erkennung von Variationen in DNA-Fragmenten, die aus Veränderungen wie Basenaustauschen, Einsprengungen, Löschungen oder Duplikationen resultieren, die die Erkennungsstellen von Restriktionsendonukleasen im Pflanzengenom beeinflussen.

Das RFLP-Prinzip umfasst das Verdauen der genomischen DNA verschiedener Individuen mit Restriktionsendonukleasen, was DNA-Fragmente unterschiedlicher Größen erzeugt. Diese Fragmente werden durch Elektrophorese getrennt und auf eine Hybridisierungsmembran übertragen. Ein spezifisches DNA-Fragment, das mit Isotopen oder Nicht-Isotopen markiert ist, dient als Sonde. Die Sonde hybridisiert mit den enzymatisch verdauten Fragmenten und zeigt Unterschiede in der Länge zwischen Fragmenten mit homologen Sequenzen zur Sonde auf.

Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) Verfahren (Sidharth Mishra et al., Fortschritte in den Veterinärwissenschaften 2019)

RFLP (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus) spiegelt Unterschiede in den Längen von DNA-Fragmenten wider, die nach der Verdauung mit Restriktionsendonukleasen entstehen, und zeigt damit die Verteilung verschiedener Enzym-Erkennungsstellen auf molekularer Ebene der DNA.

Die Vorteile von RFLP-Markern umfassen ihre überwiegend kodominante Natur sowie ihre hohe Reproduzierbarkeit und Stabilität.

Allerdings haben RFLP-Marker mehrere Nachteile, darunter komplexe experimentelle Verfahren, längere Nachweiszeiten, hohe Kosten und eine begrenzte Eignung für die großflächige molekulare Züchtung. Darüber hinaus kann die Verwendung radioaktiver Isotope bei der Detektion zu Kontamination führen. Nicht-radioaktive Markierungsmethoden sind tendenziell teurer, was zu schwächeren Hybridisierungssignalen und einer reduzierten Empfindlichkeit führt.

PCR-basierte molekulare Marker-Technologien

Die PCR-basierten molekularen Marker-Technologien der zweiten Generation sind derzeit die am weitesten verbreiteten in der molekularen Genetik. Polymorphe Marker, die durch PCR nachgewiesen werden, zu denen sowohl direkte PCR als auch PCR in Kombination mit enzymatischen Verdauungsansätzen gehören, fallen in die Kategorie der PCR-Marker. Zu diesen Markern zählen RAPD, SSR, STS, CAPS und dCAPS, unter anderem.

RAPD, zufällig amplifizierte polymorphe DNA, beinhaltet die Verwendung von kurzen, zufälligen Primern, die typischerweise 8-10 Basenpaare umfassen, um genomische DNA durch PCR zu amplifizieren. Wenn der Abstand zwischen den Bindungsstellen für zwei revers komplementäre Primer die Bedingungen für die PCR-Amplifikation erfüllt, wird ein Amplifikationsprodukt erzeugt. Jegliche Einfügungen, Löschungen oder Mutationen, die zwischen den Primer-Bindungsstellen oder an den Bindungsstellen auftreten, führen zur Anwesenheit oder Abwesenheit von Bändern im elektroforetischen Muster der PCR-Produkte, was zur Entstehung von RAPD-Markern führt.

Schematische Darstellung der Analyse der zufällig amplifizierten Längenpolymorphismen. (Satyanarayan Panigrahi et al., Mikrobielle Vielfalt im genomischen Zeitalter 2019)

Vorteile von RAPD-Markern:
Eine einfache Methode mit schneller Erkennung.
Es wird nur eine minimale DNA-Menge benötigt, und es gibt großzügige Anforderungen an die DNA-Qualität.
Dasselbe Set von Primern kann für die genomische Analyse über verschiedene Organismen hinweg angewendet werden, was die Untersuchung vollständiger Genome erleichtert.

Einschränkungen von RAPD-Markern:
Sie sind dominante Marker und können zwischen dominanten homozygoten und heterozygoten Genotypen nicht unterscheiden, was zu unvollständigen Daten führt.
Die Verwendung von kurzen Primern in RAPD-Markern macht den PCR-Prozess anfällig für experimentelle Variablen, was zu mehreren Banden und einer verringerten Konsistenz der Ergebnisse führt.

SSR-Marker, oder einfache Sequenzwiederholungsmarker, auch bekannt als Mikrosatelliten-DNA oder kurze tandemwiederholungen (STRs), stellen eine Klasse von DNA-Sequenzen dar, die aus einer wiederholenden Einheit von mehreren (1-6) Nukleotiden bestehen. Häufige Wiederholungsmotive sind (TG)n, (GA)n, (AAT)n oder (GACA)n, wobei (AT)n in Pflanzengenomen am häufigsten vorkommt. Diese Kernsequenzen sind in eukaryotischen und einigen prokaryotischen Genomen weit verbreitet und kommen zufällig in nukleärer DNA, Chloroplasten-DNA und mitochondrialer DNA vor. SSRs haben typischerweise Längen von 100 Basenpaaren oder weniger.

Das Prinzip hinter SSRs liegt in der hohen Erhaltung von Einzelkopien-Sequenzen auf beiden Seiten der Mikrosatelliten-DNA. Daher können Primer basierend auf diesen flankierenden Sequenzen für die PCR-Amplifikation entworfen werden, und die Größe der PCR-Produkte kann durch Elektrophorese bestimmt werden. Der hohe Polymorphismus der SSR-Marker resultiert hauptsächlich aus Variationen in der Anzahl der Tandemwiederholungen innerhalb der Kernsequenz.

Prinzip des SSR-Markers. (Ksenija Taski-Ajdukovic) Forschungshinweis 2015)

Vorteile von SSR-Markern:
Repräsentieren Sie co-dominante Marker, die eine Unterscheidung zwischen Heterozygoten und Homozygoten ermöglichen.
Benötigen kleine Mengen DNA-Proben und sind in Bezug auf die DNA-Qualität nicht übermäßig anspruchsvoll.
Zeigen Sie eine gute Wiederholbarkeit und hohe Zuverlässigkeit.
Zeigen Sie einen hohen Grad an allelischer Vielfalt, was zu erheblichem Polymorphismus führt.

Einschränkungen von SSR-Markern:
Das Wissen über die DNA-Sequenz an beiden Enden des Wiederholungsmotivs ist entscheidend. In Fällen, in denen diese Informationen in DNA-Datenbanken nicht zugänglich sind, werden Sequenzierung und Primerdesign notwendig, was zu höheren Entwicklungskosten führt.

AFLP-Marker, oder amplifizierte Fragmentlängenpolymorphismen bezieht sich auf polymorphe Marker, die durch die Amplifikation von mit Restriktionsenzymen verdauten DNA-Fragmenten erzeugt werden. Unterschiede entstehen durch Einzel-Nukleotid-Mutationen, Insertionen, Deletionen und andere Mutationen, die zu Veränderungen in den Erkennungsstellen der Restriktionsenzyme führen. Diese Unterschiede können durch selektive PCR-Amplifikation nachgewiesen werden. AFLP ist eine Weiterentwicklung von RFLP, wobei der Unterschied in der Nachweismethode liegt. AFLP zeigt Polymorphismen an den Restriktionsenzymstellen und anschließenden selektiven Basenvariationen.

Das Prinzip hinter AFLP basiert sowohl auf der Verdauung mit Restriktionsenzymen als auch auf der PCR-Technologie. Genomisches DNA wird zunächst mit zwei Restriktionsenzymen verdaut, was zu DNA-Fragmenten unterschiedlicher Größen führt. Künstliche Adapter werden dann an die Enden dieser Restriktionsfragmente ligiert und dienen als Matrizen für die Amplifikationsreaktion. Die Vor-Amplifikation erfolgt unter Verwendung des komplementären Strangs des künstlichen Adapters als Primer. Anschließend werden 1-3 selektive Basen zu den vor-amplifizierten Produkten als Primer für die selektive Amplifikation hinzugefügt. Die Trennung erfolgt durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese, und Polymorphismen werden basierend auf Unterschieden in den Längen der amplifizierten Fragmente nachgewiesen.

Amplifizierte Fragmentlängenpolymorphismus (G. Dorado, Referenzmodul in Biowissenschaften, 2017)

Vorteile von AFLP-Markern:
Kombiniert die Zuverlässigkeit der RFLP-Technologie mit der Effizienz der PCR-Technologie und ermöglicht die Detektion einer großen Anzahl von durch Restriktionsenzyme verdauten Fragmenten in einer einzigen Reaktion. Es liefert Informationen über 50 bis 100 Spektralbänder in einem einzigen Durchlauf.
Bietet dominante (Präsenz oder Abwesenheit von Bändern) und co-dominante (Längenunterschiede aufgrund von Insertionen oder Deletionen) Marker.
Erfordert nicht die Entwicklungskosten für beschriftete Marker, erfordert jedoch die Optimierung spezifischer Primer und Primerkombinationen.
Erfordert keine Informationen zur genomischen DNA-Sequenz.
Benötigt nur eine minimale Menge DNA.

Nachteile von AFLP-Markern:
Hohe Anforderungen an die DNA-Probenqualität.
Oft wird die Silberfärbung eingesetzt, die relativ zeitaufwendig und kostspielig sein kann.
AFLP-Marker sind nicht gleichmäßig über die Chromosomen verteilt und neigen dazu, sich in Regionen nahe den Zentromeren zu gruppieren.

SNP-Marker

SNP, was für Einzelne Nukleotid-Polymorphismen stehtist ein Marker der dritten Generation, der sich auf die Nukleotiddiversität auf genomischer Ebene bezieht. Er entsteht aus Variationen in einem einzelnen Nukleotid, wie Übergängen, Transversionen, Insertionen, Deletionen und anderen, innerhalb einer DNA-Sequenz.

SNPs können mit verschiedenen Techniken nachgewiesen und analysiert werden. Wenn eine bekannte DNA-Sequenz verfügbar ist, kann sie mit DNA-Sequenzdatenbanken, einschließlich Referenzgenomen oder Genomen eng verwandter Arten, verglichen werden, um vorhandene SNPs zu identifizieren. Darüber hinaus, wenn SNPs an bestimmten Erkennungsstellen von Restriktionsenzymen liegen, können Primer basierend auf den Sequenzen, die die SNPs flankieren, für die PCR-Amplifikation entworfen werden. Die PCR-Produkte können mit Restriktionsenzymen verdaut und einer Elektrophorese unterzogen werden, um sie in co-dominante CAPS-Marker umzuwandeln. Alternativ können Primer entworfen werden, um den SNP am 3'-Ende zu platzieren, und das Vorhandensein oder Fehlen amplifizierter Banden wird verwendet, um sie in dominante PCR-Marker umzuwandeln. Direktivere Methoden umfassen DNA-Sequenzierung oder die Verwendung von DNA-Chip-Hybridisierungstechniken zum Nachweis.

Ein schematischer Arbeitsablauf zur Entwicklung und Bewertung von SNP-Markern

SNP-Marker:

Vorteile:
Zahlreich und weit verbreitet in Genomen.
Hohe Stabilität.
Ko-dominante Natur.
Geeignet für schnelle und großflächige Screenings.

Nachteile:
Hohe Kosten bei der Verwendung von Sequenzierungs- oder DNA-Chip-Hybridisierungsmethoden.

Vergleich verschiedener DNA-Molekularmarker