Plasmidnachweis und vollständige Plasmid-DNA-Sequenzierung

Einführung in bakterielle Plasmide

Bakterielle Plasmide sind zirkuläre oder lineare doppelsträngige DNA-Moleküle, die durch ihre Fähigkeit zur autonomen Replikation in den Wirten definiert sind. Sie sind entscheidende Quellen für mikrobielle Evolution und Genominnovation aufgrund ihrer Fähigkeit, fremde DNA-Sequenzen zu erwerben und zwischen Bakterien sowie zwischen entfernt verwandten Organismen zu übertragen, wie beispielsweise durch Übertragung von Bakterien auf Eukaryoten mittels Konjugation und Mobilisierung. Bakterielle Plasmide unterliegen einer höheren Frequenz genetischer Rekombination als Chromosomen. Das Plasmidgenom, auch bekannt als das accessory oder flexible Genom, kodiert keine grundlegenden Überlebensfunktionen, sondern trägt stattdessen zur Ausnutzung bestimmter Umwelt-Nischen, Pathogenität, Abbau von Aromaten und antimikrobieller Resistenz (AMR) bei. Die Resistenz gegen Antibiotika hat die Anzahl der multiresistenten Bakterien direkt und drastisch erhöht. Daher wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um Plasmide zu erkennen und zu überwachen, indem Methoden wie komplette Plasmid-DNA-Sequenzierung.

Abbildung 1. Autonome Replikation und genomische Integration von bakteriellen Plasmiden.

Plasmidnachweismethoden

Die Plasmidnachweis ist eine grundlegende Technik, die in der molekularbiologischen Forschung weit verbreitet ist. Ihr Hauptziel ist es, die Anwesenheit, Größe und Reinheit von Plasmiden festzustellen, die wesentliche Komponenten in der Gentechnik und molekularbiologischen Studien sind. Die Methoden zum Plasmidnachweis umfassen eine Vielzahl von Ansätzen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf PCR-Amplifikation, Gelelektrophorese, Fluoreszenzfärbung, optische Kartierung und Sequenzierung.

PCR-basiertes Replikon-Typing: Dieser Ansatz zielt auf die konservierten Replikonstellen von Plasmiden ab, und die Multiplex-PCR kann erweitert werden, um gleichzeitig viele Replikons anzusprechen. Obwohl dieser Ansatz kostengünstig und schnell ist, ist es schwierig, alle neuen Plasmidgruppen abzudecken.

Pulsfeld-Gel-Elektrophorese (PFGE): Dieses Verfahren trennt verdautes DNA auf einer Gelmatrix, indem ein elektrisches Feld angelegt wird, das periodisch die Richtung ändert. Es dauert jedoch in der Regel mehrere Tage, um die Größe und Anzahl der Plasmide in einem Isolat zu bestimmen.

Abbildung 2. Pulsfeld-Gelelektrophorese (Hu & Manos 2015)

Optische Abbildung von Plasmiden: Dieses Verfahren, das auf der Dehnung von Plasmid-DNA basiert, kann verwendet werden, um die Sequenz eines Plasmids darzustellen. Allerdings ist das optische Mapping möglicherweise nicht geeignet für die Detektion von kurzen (< 50 Kb) Plasmiden.

Abbildung 3. Optische Kartierung von Plasmiden (Bogas et al., 2017).

UV-Spektrophotometrie: Die UV-Spektrophotometrie, eine weit verbreitete Technik, dient zur Bestimmung der Konzentration und Reinheit von Nukleinsäuremuster, einschließlich plasmidärer DNA. Nukleinsäuren absorbieren UV-Licht bei etwa 260 nm. Durch die Messung der Absorption bei dieser Wellenlänge kann die Konzentration von DNA in der Lösung genau bestimmt werden.

Restriktionsenzymverdau Die Plasmidverdauung mit Restriktionsenzymen ist ein entscheidender Schritt, bei dem das erwartete Enzymspaltungsmuster verwendet wird, um die Anwesenheit und Größe von Plasmiden zu bestätigen.

Fluoreszenzfärbung: Durch die Verwendung von fluoreszierenden Farbstoffen wie SYBR Green ermöglicht die Fluoreszenzfärbung die Visualisierung und Quantifizierung von Plasmiden, indem ihre Fluoreszenzsignale detektiert werden.

Sequenzierungsbasierte Plasmiddetektion: Mit der Entwicklung von Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien ist es möglich, alle Informationen, die in Plasmiden enthalten sind, zu erhalten. Whole-Genome-Sequenzierung (WGS) kann sowohl bakterielle als auch Plasmid-Sequenzdaten erfassen. Mit Algorithmen wie PlasmidSeeker und plasmidSPAdes können Plasmiddaten aus WGS-Projekten extrahiert und assembliert werden. Diese Werkzeuge können jedoch nur bekannte Plasmidsequenzen aus Roh-WGS-Daten erkennen. Um Plasmide umfassend zu analysieren, komplette Plasmid-DNA-Sequenzierung bietet ein leistungsstarkes Werkzeug zur Ermittlung der vollständigen Plasmidsequenz.

Was ist die vollständige Plasmid-DNA-Sequenzierung?

Vollständige Plasmid-DNA-Sequenzierung, auch bekannt als Whole Plasmid Sequencing oder Full Plasmid Sequencing, bezieht sich auf den Prozess der Bestimmung und Analyse der gesamten DNA-Sequenz eines Plasmids. Diese Sequenzierungsmethode ermöglicht einen umfassenden Überblick über die vollständige Konfiguration des Plasmids, einschließlich Gene, Primer, Promotoren und anderer kritischer Sequenzen, die es enthalten kann. Durch die Nutzung der Möglichkeiten von Next-Generation-Sequenzierung (NGS), PacBio-Sequenzierungoder Nanoporen-SequenzierungEs ermöglicht die Sequenzierung aller Nukleotidsequenzen innerhalb eines beliebigen Plasmids. Dieser Ansatz erleichtert eine umfassende Charakterisierung unbekannter Plasmide und eine gründliche Überprüfung bekannter Plasmide. Bemerkenswerterweise erfordert diese Methode keine Primer und ist nicht auf eine Referenzdatenbank angewiesen.

Die Rolle von Vollständige Plasmid-DNA-Sequenzierung:

Überprüfung der Sequenzintegrität: Während des Klonungs- oder Amplifikationsprozesses können Plasmide genetischen Modifikationen unterliegen, die möglicherweise zu unerwünschten Sequenzfehlern oder Mutationen führen.

Qualitätskontrolle in Klonen und Ingenieurwesen: Die Sequenzierung von Plasmiden dient als Qualitätskontrolle, um die Genauigkeit der klonierten Inserts zu bestätigen, das Fehlen unerwünschter Mutationen zu überprüfen und die Integrität des experimentellen Systems sicherzustellen.

Optimierung des Versuchsdesigns: Genaues Wissen über die Sequenz eines Plasmids ermöglicht es Forschern, Experimente effizienter zu planen. Das vollständige Verständnis der Zusammensetzung eines Plasmids liefert grundlegende Erkenntnisse, die gezielte Manipulationen leiten und deren mögliche Ergebnisse vorhersagen können.

Abbildung 4. Plasmid-Kreisdiagramm

Prozess der vollständigen Plasmid-DNA-Sequenzierung

Der Workflow für die vollständige Plasmidsequenzierung umfasst Plasmid-DNA-Vorbereitung und Qualitätskontrolle (QC), Bibliothekskonstruktion und QC, Sequenzierung und bioinformatische Analyse (einschließlich Daten-QC, de novo Assemblierung und weiterer Analyse). Bei NGS ist es schwierig, zusammenhängende Assemblierungen von Plasmiden zu erreichen, da die Lesegröße, typischerweise weniger als ∼400 bis 500 bp, nicht die volle Länge der meisten mobilen genetischen Elemente abdecken kann. Daher sind Assemblierungen von Plasmiden aus NGS-Daten oft fragmentiert oder unvollständig. Die Sequenzierung der dritten Generation, auch bekannt als Langsequenzierung, umfasst PacBio- und Nanopore-Sequenzierung, die eine schnelle Plasmidsequenzierung ermöglicht und in vielen Fällen eine vollständige Assemblierung von Plasmiden bis zum Abschluss erlaubt. Die Hauptvorteile der Anwendung Next-Generation Sequencing (NGS) Die Vorteile der vollständigen Plasmidsequenzierung liegen in ihrer überlegenen Präzision und den hohen Durchsatzfähigkeiten. Im Gegensatz dazu sind die Hauptvorteile von Nanopore-Technologie werden in ihrer optimalen Leistung mit hohem GC-Gehalt und inversen terminalen Wiederholungsstrukturen (ITR) manifestiert. Weitere Merkmale sind umfangreiche Lese-längen und verkürzte Bearbeitungszeiten.

Es sollten mehrere Vorsichtsmaßnahmen während der vollständigen Plasmid-DNA-Sequenzierung getroffen werden:

• Verwenden Sie geeignete Extraktionsmethoden und Plasmid-DNA-Extraktionskits, um Kontamination und Abbau zu vermeiden. Anschließend sollte eine genaue Messung der Plasmid-DNA-Konzentration unter Verwendung kolorimetrischer oder fluoreszierender Methoden durchgeführt werden, wobei sichergestellt wird, dass in den nachfolgenden Experimenten identische DNA-Mengen verwendet werden.
• Basierend auf den experimentellen Anforderungen und der Art der Proben sollte die geeignete Bibliothekskonstruktionsmethode, wie z.B. PCR-Amplifikation oder Transposonmethode, ausgewählt werden. Bei der Verwendung von PCR-Amplifikation sollten die PCR-Bedingungen optimiert werden, um Amplifikationsverzerrungen und die Einführung von Hybridprodukten zu verhindern, sodass eine einheitliche Länge der Plasmid-DNA-Fragmente in der Bibliothek gewährleistet ist.
• Qualitätskontrollsoftware sollte angewendet werden, um Sequenzierungsdaten zu filtern und zu trimmen, indem niedrigqualitative Reads und Adaptersequenzen entfernt werden, um die Genauigkeit der nachfolgenden Analyse zu verbessern.
• Geeignete Kontrollgruppen, einschließlich positiver, negativer und leerer Kontrollen, sollten eingerichtet werden. Dies gewährleistet die Zuverlässigkeit und Genauigkeit der experimentellen Ergebnisse. Die Wiederholung von Experimenten stärkt die Validierung und erhöht somit die Glaubwürdigkeit der Ergebnisse.

Anwendung der vollständigen Plasmid-DNA-Sequenzierung

In der Gentechnik und der molekularbiologischen Forschung, vollständige Plasmid-Sequenzierung wird eingesetzt, um die Genauigkeit und Integrität von Plasmidkonstruktionen zu überprüfen. Durch Sequenzierungsanalysen kann man die Anwesenheit der gewünschten genetischen Sequenzen, Promotoren, Tags usw. innerhalb des Plasmids bestätigen und somit die Übereinstimmung mit den Entwurfsannahmen sicherstellen. Im Hinblick auf die Forschung zur Genfunktion kann die vollständige Plasmidsequenzierung die Funktionen und regulatorischen Mechanismen der Gene innerhalb des Plasmids aufzeigen. Durch die Analyse von Plasmidsequenzen können wir die von dem Plasmid getragenen Gene identifizieren und unser Verständnis der Funktionen, Ausdrucksmuster und regulatorischen Netzwerke dieser Gene innerhalb der Zelle vertiefen.

In der Krankheitsforschung, vollständige Plasmid-Sequenzierung wird genutzt, um Plasmidvariationen und Mutationen zu identifizieren, die mit Krankheiten in Verbindung stehen. Durch den Vergleich von Plasmidsequenzen aus Patientproben mit Kontrollproben können potenzielle Genmarker identifiziert werden, die mit dem Auftreten und Fortschreiten von Krankheiten verbunden sind. Im Hinblick auf die Arzneimittelentwicklung und gezielte Therapien kann die vollständige Plasmidsequenzierung bei der Identifizierung potenzieller Arzneimittelziele helfen. Durch die Analyse der Gene und regulatorischen Elemente innerhalb des Plasmids können neuartige Ziele identifiziert werden, die mit spezifischen Krankheiten assoziiert sind, und neue Ansätze für die Arzneimittelgestaltung und -entwicklung bieten.

Im Bereich der Umweltmikrobiologieforschung stellt die vollständige Plasmidsequenzierung ein wertvolles Werkzeug zur Analyse der Zusammensetzung und Funktionalität mikrobieller Plasmide in Umweltproben dar. Durch die eingehende Untersuchung des mikrobiellen Plasmidrepertoires und seiner funktionalen Eigenschaften trägt dieser Ansatz zu einem umfassenden Verständnis mikrobieller Stoffwechseleigenschaften, ökologischer Rollen und adaptiver Strategien in unterschiedlichen Umweltkontexten bei. Darüber hinaus im Bereich der genetischen Studien, vollständige Plasmid-Sequenzierung ermöglicht die Aufklärung der genetischen Vielfalt von Plasmiden und der evolutionären Beziehungen zwischen verschiedenen Arten und Populationen. Dies trägt dazu bei, die Rollen von Plasmiden bei der genetischen Übertragung und den Anpassungsprozessen von Arten zu entschlüsseln, wodurch unser Verständnis der evolutionären Dynamik und der genetischen Mechanismen, die mikrobiellen Gemeinschaften zugrunde liegen, bereichert wird.

Vollständige Plasmid-Sequenzierung und Sanger-Sequenzierung

Sanger-Sequenzierung und vollständige Plasmid-Sequenzierung repräsentieren zwei weit verbreitete Techniken zur DNA-Sequenzierung, die jeweils einzigartige Eigenschaften bieten und dennoch eine wesentliche Beziehung zueinander haben. Die Sanger-Sequenzierung basiert hauptsächlich auf der Kettenabbruchmethode, die besonders für die Sequenzierung kürzerer DNA-Stränge wie spezifischer Gene oder Primersequenzen geeignet ist. Diese Technik findet auch Anwendung bei der Erkennung spezifischer Genmutationen. In Bezug auf die Kostenwirksamkeit bietet die Sanger-Sequenzierung eine relativ kostengünstige Lösung, die sie für kleinere Sequenzierungsprojekte geeignet macht.

Vollständige Plasmid-Sequenzierung stellt eine ausgeklügelte Technik dar, um die gesamte DNA eines Plasmids zu sequenzieren. Diese Technik nutzt hauptsächlich die Leistungsfähigkeit der Next-Generation-Sequenzierung (NGS) oder der Langlese-Sequenzierung, um die Sequenz der vollständigen Plasmid-DNA zu bestimmen. Traditionell umfasst die Sequenzierungsmethode die Amplifikation der Plasmid-DNA durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), gefolgt von der Hochdurchsatz-Sequenzierung der amplifizierten Produkte, die die Wiedergewinnung der vollständigen Plasmidsequenz ermöglicht. Diese robuste Methode eignet sich hervorragend für eine Vielzahl von Anwendungen, die den Plasmidbau und die Validierung, die Krankheitsforschung und Studien zur Umweltmikrobiologie umfassen. Ungeachtet der relativ hohen Kosten, die mit der vollständigen Plasmidsequenzierung verbunden sind, ermöglicht diese Technik den Zugang zur gesamten Sequenz eines Plasmids und macht sie zu einem unschätzbaren Werkzeug für umfassende Sequenzierungsprojekte, die umfassende Analysen erfordern.

Während sowohl das Sanger-Sequenzieren als auch vollständige Plasmid-Sequenzierung Sie dienen der Bestimmung von DNA-Sequenzen und können DNA-Sequenzinformationen über Sequenzierungsmaschinen erhalten; sie können sich unter bestimmten Bedingungen effektiv ergänzen. Zum Beispiel kann während des Prozesses der Plasmidkonstruktion die Sanger-Sequenzierung eingesetzt werden, um spezifische Regionen des Plasmids zu überprüfen, während die vollständige Plasmidsequenzierung die Vollständigkeit und Genauigkeit des Plasmids bestätigen kann.

Referenzen:

1. Roosaare M, Puustusmaa M, Möls M, et al. PlasmidSeeker: Identifizierung bekannter Plasmide aus den Sequenzdaten ganzer bakterieller Genome. PeerJ, 2018, 6: e4588.
2. Gutiérrez-Barranquero J A, Cazorla F M, de Vicente A, et al. Vollständige Sequenz und vergleichende genomische Analyse von acht einheimischen Pseudomonas syringae-Plasmiden der Familie pPT23A. BMC Genomics, 2017, 18(1): 365.
3. Jackson R W, Vinatzer B, Arnold D L, et al. Der Einfluss des Accessory-Genoms auf die Evolution bakterieller Pathogene. Mobile genetische Elemente, 2011, 1(1): 55-65.
4. Bogas D, Nyberg L, Pacheco R, et al. Anwendungen der optischen DNA-Kartierung in der Mikrobiologie. BioTechniken, 2017, 62(6): 255-267.
5. Lemon J K, Khil P P, Frank K M, et al. Schnelle Nanoporen-Sequenzierung von Plasmiden und Nachweis von Resistenzgenen in klinischen Isolaten. Journal für klinische Mikrobiologie, 2017, 55(12): 3530-3543.
6. Hu H, Manos J. Pulsfeld-Gelelektrophorese von Pseudomonas aeruginosa // Pulsfeld-Gelelektrophorese. Humana Press, New York, NY, 2015: 157-170.