Faktenblatt zur Reduzierten-Repräsentations-Sequenzierung: Methoden, Vorteile, Anwendungen und Strategien

Was ist die reduzierte Repräsentationssequenzierung (RRS)?

Die reduzierte Repräsentations-Sequenzierung (RRS) ist ein Ansatz zur Generierung von genomweiten Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten und zur Gewinnung einer großen Anzahl von genetischen Polymorphismus-Tag-Sequenzen, um die gesamten Genominformationen der Art vollständig darzustellen. RRS vereinfacht nicht nur die Sequenzierungsmethode, da nur die verdauten Fragmente sequenziert werden, sondern vereinfacht auch das sequenzierte Genom. Daher wird es häufig in der Entwicklung molekularer Marker, der Analyse der Populationsgenetik, dem Bau genetischer Karten, der QTL-Kartierung, der genomweiten Assoziationsanalyse und in anderen Bereichen der Populationsforschung und der molekularen Züchtung eingesetzt.

Einführung der für RRS verwendeten Methoden

Es gibt mehrere verschiedene Methoden der RRS, einschließlich GBS, ddGBS, RAD, 2bRAD, ddRAD, SALF, usw. Die Prinzipien dieser Methoden sind im Grunde genommen gleich, die Unterschiede liegen darin, ob Einzel- oder Doppelrestriktionsenzyme verwendet werden, ob zufällige Brüche erforderlich sind, ob ein Barcode benötigt wird, ob ein spezielles Kit erforderlich ist, das Design des Adapters und andere Details. Die detaillierte Einführung in diese Methoden ist wie folgt:

Abbildung 1. Experimenteller Prozess jeder Methode

Vorteile von RRS

• Es werden nur die verdauten Fragmente sequenziert, was die Komplexität des Genoms erheblich reduziert.
• Nicht beschränkt auf das Referenzgenom, auch anwendbar auf Arten ohne Referenz.
• Kosteneffektiv, hohe Stabilität, besonders geeignet für die Analyse einer großen Anzahl von Proben.
• Breites Anwendungsspektrum: Populationsgenetik, genetische Kartierung, QTL-Kartierung, genomweite Assoziationsanalyse, molekulare Züchtung, usw.

Vergleich verschiedener von RRS verwendeter Methoden

Die detaillierten Unterschiede in den verwendeten Methoden der RRS bestimmen ihre Unterschiede in der Anwendung. In der folgenden Tabelle werden verschiedene RRS-Methoden verglichen: (siehe Tabelle 1)

Anwendung von RRS

• Entwicklung von molekularen MarkernIdentifizierung einzelner SNPs/InDel-Marker, Integration von Populations-SNP-Markern; Berechnung der genetischen Verknüpfungsdistanz polymorpher Marker, Konstruktion hochdichter genetischer Karten und Durchführung von Assoziationsanalysen für bestimmte Merkmale, Durchführung von Feinkartierungen von nachgelagerten Genen.
• Konstruktion genetischer Karten und QTL-KartierungDifferenzierung von Verknüpfungsgruppen, Einstufung massiver Marker, Screening von verzerrten Segregationsstellen; QTL-Kartierung basierend auf phänotypischen Daten.
• Populationsgenetische EvolutionAnalyse der genetischen Ebene der Population basierend auf SNP-Daten, einschließlich Analyse der Populationsentwicklung, Analyse der Populationsstruktur, Genfluss, Abstammungstests, PCA-Analyse, usw.
• Helfen Sie beim Zusammenbau von von neuem detaillierte Genomkarte: Zusammenstellung des Entwurfsgenoms, Genannotierung, usw.
• Genomweite Assoziationsanalyse (GWAS)Sequenzierung und Ganzgenom-Assoziationsanalyse für eine bestimmte Artenpopulation sowie Screening von genombezogenen regulatorischen Stellen für spezifische Merkmale.

Strategie der Auswahl in RRS-Methoden

• Zweck der Studie:

  Je nach den unterschiedlichen experimentellen Zwecken variiert die Anzahl der benötigten Marker erheblich. Für Studien, die notwendig sind, um Forschung zu funktionalen Intervallscans und funktionalem Gen-Mining im gesamten Genom durchzuführen, wie GWAS und Analysen des Selektionsdrucks, werden Zehntausende von hochdichten Molekülen benötigt. Die Dichte der molekularen Marker für Studien zu phylogenetischen Beziehungen, Kopplungsanalysen, geografischer Populationsstruktur, Genfluss und Abstammungstests muss jedoch nicht so hoch sein; in der Regel genügen einige Hundert bis einige Tausend molekulare Marker, um die Studien abzuschließen. Bei Genkartierungsstudien beeinflussen auch unterschiedliche Forschungsressourcen und Kartierungspopulationen die Anzahl der benötigten Marker. Zum Beispiel hängt die Anzahl der für die genomweite Assoziationsanalyse mit natürlichen Populationen erforderlichen Marker von der LD-Abklingdistanz der Art ab; je schneller der Abfall, desto mehr Marker werden benötigt.

  Die Anzahl der Marker, eingestuft nach: RAD≥GBS/SLAF>2b-RAD, sodass die Anzahl der für die Studie benötigten Marker zunächst bewertet werden kann und anschließend die geeignete vereinfachte Genomsequenzierungstechnologie ausgewählt werden kann.

• Mit oder ohne Referenzgenom:

  Wenn die Forschungsart kein Referenzgenom hat oder die Qualitätsstufe des Referenzgenoms schlecht ist, kann die RAD-Technologie häufiger verwendet werden, da die RAD-Technologie Fragmente von bis zu 400~500 bp durch partielle Assemblierung erhalten kann, was die Entwicklung von SSR-Molekularmarkern und das anschließende Primerdesign begünstigt; GBS/SLAF kann ebenfalls Clusterverfahren verwenden, um Konsenssequenzen zu erstellen, um SNPs zu detektieren; 2b-RAD ist aufgrund seiner kurzen Fragmente anfällig für Störungen durch repetitive Sequenzen, und es ist nicht förderlich, Primer zu entwerfen, um die durch Sequenzierung erhaltenen SNPs zu überprüfen. Daher erfordert 2b-RAD normalerweise ein Referenzgenom.

• Auswahl von Restriktionsenzymen:

  Die Wahl des Enzyms wird durch die Anforderungen an die Markerdichte bestimmt. Das ausgewählte Enzym sollte für die untersuchte Art geeignet sein (zum Beispiel sollte die Anzahl der Enzyme in den repetitiven Regionen der Art berücksichtigt werden); einige Enzyme sind für bestimmte Arten geeignet, aber nicht unbedingt für andere Arten; Enzymverdauungsfragmente haben normalerweise klebrige Enden, und unterschiedliche klebrige Enden können unterschiedliche Adapterdesigns erfordern.

• DNA-Probenvorbereitung:

  Die Effizienz der Verdauung durch Enzyme macht hochwertige DNA-Proben für den gesamten Prozess entscheidend; zudem erfordern verschiedene Methoden unterschiedliche Volumina an DNA-Proben.

Tabelle 1. Vergleich verschiedener Methoden, die von RRS verwendet werden