Die Vorteile und der Arbeitsablauf von 2b-RAD

Was ist RAD-seq?

Heutzutage ist die Anwendung von reduzierter Repräsentations-Sequenzierungstechnologie in der großflächigen und hochdurchsatzfähigen SNP-Genotypisierung ein heißes Forschungsgebiet. Restriktionsenzyme werden eingesetzt, um genomische DNA zu fragmentieren, dann werden einige charakteristische Fragmente ausgewählt und der nächsten Generation von Sequenzierungstechnologien unterzogen, um genetische Marker im Genom auf hochdurchsatzfähige Weise zu identifizieren. Die am häufigsten verwendete Technologie der reduzierten Repräsentations-Sequenzierung, die restriktionsstellenassoziierte DNA-Sequenzierung (RAD-seq), wurde von Forschern der University of Oregon entwickelt. Im Vergleich zu Paar-End- und Mate-Pair-Bibliotheken kann die RAD-seq-Technologie mit der Pooling-Methode bis zu 96 Sequenzierungsbibliotheken auf einmal erstellen, was für den experimentellen Betrieb recht praktisch und kosteneffektiv ist. Noch wichtiger ist, dass sie nicht auf die Informationen des Referenzgenoms angewiesen ist.

RAD-seq-Technologie ist ein Hochdurchsatz-Sequenzierung spezifischer Restriktionsenzymfragmente. Millionen von genetischen Markern des Polymorphismus können durch einmalige Sequenzierung gewonnen werden, und RAD-seq wird in der Ökologie, Genetik, Genomik und anderen Forschungsbereichen weit verbreitet eingesetzt. Je nach Art und Menge des verwendeten Restriktionsendonukleasen kann RAD-seq in ursprüngliches RAD-seq unterteilt werden, 2b-RAD, ddRAD, ezRAD, GBS (Genotypisierung durch Sequenzierung) und andere Methoden.

Vorteile von 2b-RAD gegenüber anderen RAD-seq-Methoden

2b-RAD ist eine Art von RAD-seq-Technologie, die auf der Grundlage von einheitlichen Fragmenten durchgeführt wird, die durch Typ IIB Restriktionsendonukleasen erzeugt werden. 2b-RAD überwindet effektiv einige der Einschränkungen von RAD-seq, wie den komplizierten Bibliotheksaufbau und die variierenden Längen der restriktierten DNA-Fragmente. Wir haben die Hauptvorteile von 2b-RAD im Vergleich zu anderen RAD-Sequenzierungstechnologien überprüft, die wie folgt aufgelistet sind.

(1) Mehr Arten und Zahlen von MarkernDie Anzahl der Loci, die durch verschiedene RAD-seq-Technologien erhalten werden, variiert stark. Insgesamt kann 2b-RAD mehr Loci erfassen und ist besser geeignet, um die evolutionären Beziehungen, die Populationsstruktur, den Genfluss und andere verwandte Probleme zu untersuchen. Neben SNP kann 2b-RAD auch dominante Marker und CNV-Informationen bereitstellen.

(2) Unabhängige Tags2b-RAD-Tags sind unabhängig, was die Datenredundanz verringern und den Informationsgehalt erhöhen kann. Andere Rad-seq-Technologien erfassen wahrscheinlich eine Sequenz auf jeder Seite einer Restriktionsstelle, und die Informationen, die von benachbarten Fragmenten bereitgestellt werden, sind vollständig verknüpft, was der Redundanz der Daten entspricht. Die 2b-RAD-Technik bietet mehr Informationen, da der Kontaktpunkt auf beiden Seiten liegt, was es unmöglich macht, dass zwei Tags vollständig benachbart sind.

(3) Alle BibliothekssequenzenFür 2b-RAD werden alle Enzymfragmente, die von Restriktionsenzymen geschnitten werden, für die Sequenzierung verwendet, um sicherzustellen, dass die Restriktionsstellen nicht verloren gehen. Dies ermöglicht eine ultra-hochdichte Abdeckung des Genoms, und die Informationen sind vollständiger. Theoretisch beträgt der durchschnittliche Verteilungsabstand der 2b-RAD-Tags im Genom 2 kb. Das bedeutet, dass in einem Genom von 1G-Größe mehr als 200.000 Tags gewonnen werden können.

(4) Hohe WiederholgenauigkeitDer Prozess von 2b-RAD ist einfach und weist eine hohe technische Wiederholbarkeit auf. Das Ergebnis ist nach zweimaliger Sequenzierung einer Probe äußerst konsistent. Es verwendet die N+1-Strategie, sodass jedes Projekt standardmäßig eine technische Wiederholung für eine Einzelprobe durchführt. Das bedeutet, dass dieselbe Probe die Bibliothekssequenzierung einmal wiederholt, wobei sichergestellt wird, dass die Tag-Wiederholrate der gleichen Probe zwischen zwei Experimenten nicht weniger als 95% betragen sollte und die Markierungswiederholrate nicht weniger als 85%.

(5) Einheitliche SequierungstiefeDie 2b-RAD-Technik erzeugt Enzym-Schneidetags mit gleicher Länge von 33-36 bp, die für die nachfolgende Hochdurchsatz-Sequenzierungsreaktion angereichert werden. Die genomweite Hochdurchsatz-SNP-Screening- und Typisierungsanalyse wird durch bioinformatische Analysen erreicht. Die einheitliche Sequierungstiefe gewährleistet die Zuverlässigkeit und Genauigkeit jedes Tags.

Tabelle 1. Die Vorteile von 2b-RAD gegenüber anderen Rad-seq-Technologien.

Workflow von 2b-RAD

Der Kern von 2b-RAD ist die Anwendung von Typ IIb Restriktionsendonukleasen (Abbildung 1). Diese Art von Endonuklease erkennt sechs Basen von doppelsträngiger DNA, und schneidet dann die DNA stromaufwärts und stromabwärts der Erkennungsstelle ab, was zu einer 27 bp langen Tag-Sequenz führt. Das 3'-Ende des Tags ist mit 3 Basen hervorgehoben, die ebenfalls völlig zufällig in ihrer Zusammensetzung sind. Der für Plattformen mit Hochdurchsatz-Sequenzierung geeignete Adapter wird an beiden Seiten des Tags ligiert, nach der PCR-Amplifikation kann er für die Sequenzierung verwendet werden.

Abbildung 1. Vorbereitung und Sequenzierung von 2b-RAD-Tags.

(1) Probenvorbereitung und AufschlussGenomisches DNA wird extrahiert und ihre Konzentration sowie Protein- und RNA-Kontaminationen werden nachgewiesen. Die DNA wird mit Restriktionsenzym II verdaut. Eine zusätzliche Probe kann gleichzeitig verdaut werden, um die Verdauungseffizienz durch 1% Agarosegel-Elektrophorese zu überprüfen. Das primäre DNA-Band verschwand und wurde dispergiert, was auf eine erfolgreiche Verdauung hinweist.

(2) Adapter verbindenSpezifische Adapter werden an die oben erzeugten Restriktionsfragmente angeheftet. In diesem Stadium kann die reduzierte Tag-Darstellung (RTR) erhalten werden, um eine Teilmenge der Restriktionsstellen für die Genotypisierung anzusprechen.

(3) VerstärkungDie PCR-Amplifikation verwendet eine hochfidele DNA-Polymerase und ein Set von Primern. Diese Primer können stichproben-spezifische Barcodes und die für die Bead-Anreicherung im Sequenzierungssystem erforderlichen Sequenzen einführen. Im Durchschnitt werden drei Amplifikationsreaktionen für jede Probe durchgeführt und zusammengeführt. Die zusammengeführten PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese gereinigt.

(4) Sequenzierung. Qualifizierte Bibliotheken werden entweder auf SOLiD- oder Illumina-Plattformen sequenziert. Standard BsaXI-Bibliotheken für Illumina werden serialisiert und dann im paired-end-Verfahren mit der Hiseq X-ten, PE150 oder der Hiseq 2500 v2-Plattform sequenziert.

(5) QualitätskontrolleDie SOLiD- und Illumina-Plattformen erzeugen Reads mit einer Länge von 35 bp. Die Position des terminalen Tags sollte bei jeder Lesevorgang ausgeschlossen werden, um den Einfluss von Artefakten zu beseitigen. Anschließend werden lange Homo-Polymerregionen, übermäßig niedrige Qualitätspositionen und unklare Reads entfernt. Die verbleibenden hochqualitativen Reads werden für die nächste Analyse verwendet.

(6) SequenzalignierungFür die referenzbasierte Analyse wird das SHRiMP-Softwarepaket zur Ausrichtung von hochwertigen Reads gegen die Referenzdatenbank verwendet. Für von neuem Analyse, das CD-HIT-Softwarepaket wird für Organismen verwendet, die über keine vollständige Genomsequenz verfügen.

(7) Fortgeschrittene Analyse

I) Hochpräzise Konstruktion von Verknüpfungskarten. Basierend auf den Ergebnissen der Genotypisierung kann die Joinmap-Software verwendet werden, um die genetische Verknüpfungskarte zu erstellen, und schließlich die genetische Karte mit MergeMap und anderer Software zu integrieren.

II) Lokalisierung von quantitativen Merkmalsloci (QTL). Basierend auf den phänotypischen Daten und dem hochdichten Kopplungskarten kann der genaue QTL-Standort des quantitativen Merkmals oder Qualitätsmerkmals bestimmt werden. Die Ergebnisse der Korrelationsanalyse können verwendet werden, um die Zuverlässigkeit der QTL-Analyseergebnisse zu beurteilen.

III) Populationsgenetik. Anhand der Anzahl der Marker zwischen verschiedenen Gruppen und zwischen verschiedenen Individuen innerhalb der Gruppe, der Anwesenheit oder Abwesenheit desselben Markers, der Genfrequenz und Genotypfrequenz von SNP-Markern innerhalb des Markers können die Populationsdifferenzierung und Evolution bewertet werden.

Bei CD Genomics bieten wir Ihnen hochwertige Sequenzierung und integrierte Bioinformatik Analyse für dich SNP-Genotypisierung Projekt. Wenn Sie zusätzliche Anforderungen oder Fragen haben, zögern Sie bitte nicht, uns zu kontaktieren.

Referenzen:

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