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Epigenomik-Sequenzierung: DNA-Methylierungsanalysen zwischen Eukaryoten und Prokaryoten
Was ist DNA-Methylierung?
Seit mehr als einem Jahrzehnt wurde angenommen, dass durch Methylierung veränderte Basen in der DNA nur in geringer Häufigkeit vorkommen. Methyltransferasen (DNA-Methylasen), die die chemisch aktive Methylgruppe von S-Adenosylmethionin entweder auf Kohlenstoff 5 der Cytosinlösungsmittel oder auf die exozyklische Aminogruppe übertragen, die an Kohlenstoff 6 der Adeninreste gebunden ist.m6A) der DNA-Kette sind an dieser DNA-Veränderung beteiligt.
Abbildung 1. DNA-Methylierungswege. (Moore et al., 2013)
Der DNA-Methylierungssequenz ist artspezifisch. Ein winziger Anteil der Cytosinreste ist in der DNA einiger Prokaryoten methyliert, während nur Adeninreste in einigen methyliert sind. Die DNA enthält sowohl 5-Methylcytosin (m5Cyt) als auch N6-Methyladenin (m6Ade) in der dritten Gruppe prokaryotischer Organismen. Insgesamt wird die DNA eukaryotischer Organismen ausschließlich durch Cytosinreste methyliert.
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DNA-Methylierung in Prokaryoten
DNA-Methylierung wird in Bakterien als Signal für die Regulation einer bestimmten DNA-Protein-Interaktion genutzt. In der Regel bestehen Methylierungsprozesse aus einer DNA-Methylase und einem oder mehreren Proteinen, die an die DNA binden und mit der Ziel-Methylierungsstelle auf der DNA übereinstimmen können, wodurch die Methylierung dieser Stelle blockiert wird.
Die Methylierung der Zielstelle schränkt die Proteinbindung ein, was zu zwei methylierte und nicht-methylierte alternativen Methylierungszuständen der Zielstelle führen kann. Dies führt tendenziell zu einer Sequenz von DNA-Methylierung das bestimmt, welche Gene angezeigt werden und somit, wie das Ökosystem mit einem Mikroorganismus interagiert.
In Bakterien, Archaeen und Phagen-Genomen gibt es begrenzte Mengen an C5-Methylcytosin, N4-Methylcytosin und N6-Methyladenin. Die DNA-Methylierung erfolgt nach der Replikation und wird durch DNA-Methyltransferasen erleichtert, die spezifische Sequenzen anvisieren. Prokaryotische DNA-Methyltransferasen fallen in zwei Kategorien: solche, die in Restriktions-Modifikationssysteme integriert sind, und eigenständige Enzyme, die keinen entsprechenden Restriktionsenzym-Gegenpart haben. Die Hauptfunktionen von DNA-Methylierung beziehen sich auf die Modulation von Wechselwirkungen zwischen DNA-bindenden Proteinen und ihren jeweiligen Zielstellen. Zu diesen Funktionen gehören der Schutz gegen DNA-Einschränkungen, die Erleichterung der Strangunterscheidung während der Mismatch-Reparatur, die Regulierung des Zellzyklus und die Kontrolle der Transkription. DNA-Methylierung beeinflusst auch die Interaktionen von bakteriellen Krankheitserregern mit ihren Wirten, was potenzielle Anwendungen für epigenetische Therapien im Kampf gegen Infektionskrankheiten nahelegt.
Abbildung 2. Schematische Übersicht über die Evolution der prokaryotischen DNA-Methylierungsmuster mit vier evolutionären Mechanismen. (Anton et al., 2021)
DNA-Methylierung bei Eukaryoten
DNA-Methylierung In Eukaryoten wird häufig verwendet, um die Signalfunktion der Gene abzuschalten. In vielen eukaryotischen Mechanismen, wie embryonalem Wachstum, Genom-Imprinting, Inaktivierung des X-Chromosoms und normalerweise der Aufrechterhaltung der Konsistenz der Chromosomen, DNA-Methylierung hat sich als eine wichtige Funktion erwiesen. Bei Säugetieren, wo die Methylierungsphase für 75 % aller CpG-Dinukleotide in somatischen Zellen stattfindet, ist der Prozess sehr präzise.
In Anbetracht des Ausmaßes des Einflusses von DNA-MethylierungEs ist nicht verwunderlich, dass mehrere Krankheiten, wie sie beim Menschen beobachtet werden, ebenfalls mit diesen Effekten verbunden sind. Der globale Methylierungstrend bei Säugetieren erschwert die Beurteilung, ob Methylierung eine Standard-Situation ist oder auf bestimmte Gen-Sequenzen abzielt. Die CpG-Inseln treten jedoch typischerweise in der Nähe von Transkriptionsstartstellen auf, was impliziert, dass es einen Identifizierungsrahmen gibt.
Abbildung 3. Evolutionäre Beziehung der eukaryotischen DNA-Methyltransferasen. (Schmitz et al., 2019)
Unterschiede in der DNA-Methylierung zwischen Prokaryoten und Eukaryoten
DNA-Methylierung tritt bei Eukaryoten nur an den Resten von Cytosin auf, insbesondere bei CpG-Sequenzen. Bei Prokaryoten hingegen ist das Hauptsignal der Epigenetik die Methylierung von Adenin-Resten. Eukaryoten verwenden nur eine Handvoll von DNA-Methyltransferasen; bei Bakterien, wo viele von ihnen eine hohe Sequenzgenauigkeit aufweisen, sind die Zahlen viel höher. Der bedeutende menschliche Magenpathogen Helicobacter pylori hat beispielsweise ein umfangreiches Genrepertoire für DNA-Methyltransferasen, wobei verschiedene Stämme unterschiedliche und eher spezielle Sequenzen aufweisen.
Dennoch ist der Abwehrmechanismus bei Prokaryoten und Eukaryoten der gleiche. DNA-Methylierung vergleichbar. Bei Menschen und Nagetieren können beispielsweise eingebettete virale Sequenzen methyliert werden, um die implementierten Gene zu unterdrücken. Auch bei Mäusen wurden die gleichen Prozesse entdeckt, die Transgene unterdrücken. Die Erkennungs- und Beseitigungsmerkmale von DNA-Methylierung Maschinen scheinen daher erhalten zu sein.
Da das eukaryotische Genom im Vergleich zum prokaryotischen Genom viel komplexer ist, wurde der Einfluss von methylierter Cytosin als "fünfter Base" im eukaryotischen Genom von vielen Forschungen vorgeschlagen. Darüber hinaus haben viele Studien gezeigt, dass die Methylierung von Cytosin an der funktionalen Reorganisation des eukaryotischen Genoms beteiligt ist.
Tabelle 1 Unterschied zwischen DNA-Methylierung in Prokaryoten und Eukaryoten
| Aspekt | Prokaryoten | Eukaryoten |
| Art der Methylierung | In der Regel N6-Methyladenin (N6-mA) | In der Regel C5-Methylcytosin (C5-mC) |
| Funktion | Assoziiert mit Restriktions-Modifikationssystemen, Verteidigung gegen fremde DNA | Beteiligt an der Regulierung der Genexpression, der Genomstabilität und der Zell-Differenzierung. |
| Methyltransferase-Typ | Häufig Teil von Restriktions-Modifikationssystemen, die spezifisch für doppelsträngige DNA-Sequenzen sind. | Komplexer, kann spezifisch für Sequenzen sein, hat aber auch einen breiteren Kontext der Methylierung. |
| Erbschaft | Typischerweise vertikal vererbt, wird durch Zellteilung an Nachkommenschaftszellen weitergegeben. | Durch Zellteilung vererbt und in einigen Fällen über Gameten an die Nachkommen weitergegeben. |
DNA-Methylierungs-Sequenzierungsmethoden
Die Analyse des DNA-Methyloms wurde unter Verwendung von durchgeführt. Mikroarrays Seit vielen Jahren. Die Sequenzierung der DNA-Methylierung ist eine neu entwickelte Innovation, die hauptsächlich auf der Bisulfit-Konversion basiert, um zwischen methylieren Cytosinen und unmethylieren Cytosinen zu unterscheiden. Unmethylierte Cytosine werden bei der Bisulfit-Diagnose in Uracile umgewandelt, während 5mCs nicht reaktiv sind und erhalten bleiben. Unmethylierte Cytosine werden in der Sequenzierungsphase als Thymin gelesen, während methylierte Cytosine weiterhin als Cytosin gelesen werden.
Abbildung 4. Die Entwicklung der Methodik zur DNA-Methylierungsprofilierung. (Li et al., 2021)
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Die auf Bisulfitumwandlung basierende Sequenzierung kann entweder durchgeführt werden als Whole-Genome-Bisulfid-Sequenzierung (WGBS) oder Reduzierte Repräsentation Bisulfid-Sequenzierung, basierend auf der genomischen Abdeckung (RRBS). WGBS kostet mehr und es gibt eine viel größere Beteiligung an der zugehörigen Datenauswertung. Stattdessen bietet RRBS eine kostengünstige Methode zur Untersuchung der DNA-Methylierung, indem genomische Bereiche, die reich an CpG sind, beprobt werden. Genomische DNA wird mit einem methylierungsunempfindlichen Restriktionsenzym, wie MspI, verarbeitet, um durchzuführen RRBSUm eine Bibliothek für die Sequenzierung zu erstellen, werden die verdauten DNA-Fragmente dann auf Adapterligatur, Bisulfit-Konversion und PCR beschränkt.
Abbildung 5. Übersicht über WGBS und RRBS. (Li et al., 2021)
WGBS und RRBS sind zwei Sequenzierungstechniken, die auf der Bisulfitbehandlung basieren. Darüber hinaus umfassen die Methoden, die diesen Ansatz nutzen, gezielte DNA-Methylierungs-/Hydroxymethylierungs-Sequenzierung (oxBS-seq). In oxBS-seqDie Umwandlung von 5-Hydroxymethylcytosin (5hmC) zu 5-Formylcytosin (5fC) und anschließend zu Uracil (U) nach der Bisulfidbehandlung ermöglicht die präzise Identifizierung von 5-Methylcytosin (5mC). OxBS-seq präsentiert einen vereinfachten experimentellen Arbeitsablauf im Vergleich zu BS-seq, der die spezifische Quantifizierung von 5mC und 5hmC an jedem modifizierten Cytosinstandort in der DNA-Probe ermöglicht.
Die zweite Kategorie umfasst Sequenzierungsmethoden, die auf der spezifischen Antikörperbindung basieren, hauptsächlich einschließlich methylierte DNA-Immunpräzipitations-Sequenzierung (meDIP-seq), Hydroxymethylierte DNA-Immunpräzipitations-Sequenzierung (hmeDIP-seq), und 6mA-Immunopräzipitation-Sequenzierung (6mA-IP-seq). meDIP-seq ist eine Technik zur Erkennung der gesamten Genom-Methylierung, die auf dem Prinzip der Antikörperanreicherung basiert. Sie verwendet die immunopräzipitierte Methylierung von DNA, um DNA-Fragmente, die im Genom methyliert sind, selektiv mit 5mC-Antikörpern anzureichern. Anschließend ermöglicht das Hochdurchsatz-Sequencing hochpräzise Studien zu CpG-dichten und stark methylierten Regionen auf der Ebene des gesamten Genoms. 6mA-IP-seq verwendet Antikörper, die für die DNA-6mA-Modifikation entwickelt wurden, um gezielt genomische Regionen anzureichern, die die 6mA-Modifikation aufweisen. In Kombination mit Hochdurchsatz-SequenzierungDieser Ansatz ermöglicht eine präzise Kartierung von 6mA-Modifikationen im Genom. 6mA-IP-seq bietet erhebliche Vorteile, darunter hohe Präzision, breites Erkennungsfeld, außergewöhnliche Zielgenauigkeit und vielseitige Anwendbarkeit.
Abbildung 6. Schlüsselprinzip von MeDIP-seq. (Li et al., 2021)
Darüber hinaus sind DNA-Methylierungsprofilierungsstudien von Einzelzellen und kleinen Proben erheblich durch die Sequenzierungstechnologien zur Bibliothekskonstruktion eingeschränkt. Traditionelle Methoden zur Bibliothekskonstruktion oder Einzelzell-Amplifikationstechniken, die genomischer DNA ähneln, sind in Methylierungsexperimenten schwer anzuwenden. Das Einzelzell-Whole-Genome-Bisulfid-Sequencing (scWGBS) adressiert diese Einschränkung. scWGBS ist ein hochinnovativer Ansatz, der die Vorbereitung von scWGBS-Bibliotheken mit Illumina kombiniert. Next-Generation-Sequenzierung Technologie. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung des Methylierungsstatus des Genoms mit Einzelzellauflösung und deckt die Zellheterogenität auf, die normalerweise durch standardisierte Bulk-Methylierungssequenzierung maskiert wird. Methylierungsstudien an Einzelzellen und seltenen Proben werden hauptsächlich in den Bereichen Tumormechanismen, Krebsforschung, Präimplantationsdiagnostik, frühe embryonale Entwicklung, Keimzellrekombination, Stammzellen und Forschung zur Zellheterogenität angewendet.
Referenzen:
- Moore, L., Le, T. & Fan, G. DNA-Methylierung und ihre grundlegende Funktion. Neuropsychopharmakologie2013, 38, 23–38.
- Li S, Tollefsbol T O. Methoden der DNA-Methylierung: Globale DNA-Methylierung und methylomische Analysen. Methoden, 2021, 187: 28-43.
- Casadesús J, Sánchez-Romero M A. DNA-Methylierung in Prokaryoten[M]//DNA-Methyltransferasen - Rolle und Funktion. Cham: Springer International Publishing, 2022: 21-43.
- Anton B P, Roberts R J. Über Restriktionsmodifikation hinaus: epigenomische Rollen der DNA-Methylierung in Prokaryoten. Jahresbericht der Mikrobiologie, 2021, 75: 129-149.
- Schmitz R J, Lewis Z A, Goll M G. DNA-Methylierung: gemeinsame und unterschiedliche Merkmale bei Eukaryoten. Trends in Genetics, 2019, 35(11): 818-827.
