Die Einführung und der Workflow der vorgefertigten Bibliothekssequenzierung

Was ist vorgefertigte Bibliothekssequenzierung?

Für Next-Generation-SequenzierungVollautomatisierte Sequenzierungsläufe zu niedrigeren Kosten pro Base und schnelleren Assay-Zeiten sind mit den kürzlich eingeführten Hochdurchsatz- und Tischgeräten verfügbar. Infolgedessen wurde ein wichtiges Engpass im komplexen und zeitaufwändigen Prozess der Bibliotheksvorbereitung festgestellt, der mit isolierten Nukleinsäuren beginnt und mit amplifiziertem und barcodiertem DNA mit Sequenzierungsadaptern endet. Die Protokolle zur Bibliotheksvorbereitung sind in der Regel mehrstufige Prozesse, die teure Reagenzien und viel praktische Zeit erfordern. Um Robustheit und Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, wird ein starker Fokus auf Standardisierung erforderlich sein.

Fertighausbibliothekssequenzierung ist häufig Hochdurchsatz-Sequenzierung ansatz, der zur Analyse von genomischen Informationen innerhalb von DNA-Proben verwendet wird. Der Hauptfokus liegt auf Vorbibliotheks-Sequenzierung liegt in der Vorbereitung von DNA-Bibliotheken, die vorbereitete DNA-Fragmente enthalten, die bereit für die Sequenzierung sind. Diese DNA-Fragmente stammen normalerweise aus verschiedenen Proben, die in der biologischen Forschung verwendet werden. Vorbibliotheks-Sequenzierung kann durchgeführt werden mit Zweitgeneration-Sequenzierung Plattformen sowie Plattformen der dritten Generation der Sequenzierung wie PacBio SMRT-Sequenzierung und Nanoporen-Sequenzierung.

Was ist der Workflow der Sequenzierung mit vorgefertigten Bibliotheken?

Vorbereitung von Sequenzierungsbibliotheken:

Abbildung 1. Grundlegender Arbeitsablauf für die NGS-Bibliotheksvorbereitung. (Head et al., 2014)

• DNA- und RNA-Sequenzierungsbibliotheken

Beginnend mit genomischer DNA oder RNA kann eine Sequenzierungsbibliothek erstellt werden. Der Arbeitsablauf zur Erstellung einer DNA-Sequenzierung Die Bibliothek besteht aus drei grundlegenden Schritten:
- Fragmentierung und Größenbestimmung von Nukleinsäuren (DNA oder RNA), um Fragmente einer vorbestimmten Länge zu erhalten,
- Verbindung von Adaptern an den Fragmentenden, und
- Bibliotheksquantifizierung.

Es gibt einen zusätzlichen Schritt in jedem RNA-Sequenzierung Bibliothek: RNA-Umwandlung in cDNA. Das Fragmentierungsverfahren kann entweder vor oder nach der cDNA-Synthese durchgeführt werden.

• Fragmentierung

Physikalische Methoden, enzymatische Methoden und chemische Methoden können alle verwendet werden, um Nukleinsäuren (DNA, RNA oder cDNA) zu fragmentieren. Die am häufigsten verwendeten Techniken sind physikalische und enzymatische. Insbesondere können lange Fragmente für Mate-Pair-Bibliotheken (6.000 bis 20.000 bp) erreicht werden.

• Fragmentgröße

Die Größe der Fragmente ist äußerst wichtig. Die ideale Fragmentgröße für die Bibliothek wird durch die zu verwendende Plattform und den Umfang der Analyse bestimmt. Bei Illumina-Plattformen können beispielsweise Fragmente von bis zu 1.500 bp verwendet werden, im Falle von Exom-SequenzierungEs wird jedoch eine maximale Einfügegröße von 200-250 bp empfohlen. Dies liegt an der durchschnittlichen Größe eines menschlichen Exons von 200 Basenpaaren.

• Befestigung der Adapter

Die sogenannten Adapter müssen an beiden Enden jedes Fragments angebracht werden, sobald die Fragmentierung von DNA oder RNA abgeschlossen ist. Per Definition ist eine Sequenzierungsbibliothek eine Sammlung von DNA-Fragmenten mit angeschlossenen Adaptern. Adapter sind so konzipiert, dass sie mit einer spezifischen Sequenzierungsplattform, wie der Oberfläche einer Flusszelle oder Perlen, funktionieren. Nach dem Anbringen der Adapter erfolgt eine Größenbestimmung, während der alle Fragmente unerwünschter Größe und alle Adapter-Dimere entfernt werden. Adapter-Dimere entstehen, wenn Adapter ohne eine Bibliotheks-Insert-Sequenz selbstligieren, und sie sind besonders häufig, wenn die anfängliche DNA-Menge gering ist. Es ist entscheidend, Adapter-Dimere aus der Bibliothek zu entfernen, da sie den Sequenzierungsausstoß erheblich reduzieren können, indem sie wertvollen Platz auf der Flusszelle beanspruchen. Eine Reinigung mit magnetischen Perlen kann die Dimere effektiv entfernen.

• Bibliotheksquantifizierung

Die Quantifizierung der Bibliothek ist ein kritischer Schritt, der mit der präzisesten und praktischsten Methode durchgeführt werden sollte. Auf PCR basierende Methoden (digitale PCR oder quantitative PCR) werden häufig verwendet, um Sequenzierungsbibliotheken zu quantifizieren.

• Die endgültige Qualität der Sequenzierungsbibliothek

Beim Erstellen einer Sequenzierungsbibliothek ist es entscheidend, das höchste Maß an Komplexität anzustreben. Mit anderen Worten, es ist wichtig, dass die endgültige Bibliothek so viel wie möglich von der Einzigartigkeit des ursprünglichen Materials erfasst. Die Begrenzung der Anzahl segmentaler Duplikate ist der erste Schritt, um dieses Ergebnis zu erzielen. Je kürzer die Fragmente sind, desto wahrscheinlicher ist es, dass sie weniger spezifisch sind und an mehreren Loci in der Referenzsequenz ausgerichtet werden. Daher kann der Prozentsatz der Duplikatlesungen in den Sequenzierungsdaten verwendet werden, um die Komplexität der Bibliothek zu bestimmen.

Sequenzierung:

Nach der Durchführung von Qualitätskontrollen und Amplifikationsverfahren wird die DNA-Bibliothek für Hochdurchsatz-Sequenzierung auf einem Sequencer. Die Sequenzierung von vorgefertigten Bibliotheken nutzt typischerweise Plattformen wie Illumina, die in der Lage sind, eine beträchtliche Menge an kurzen Sequenzlesungen zu erzeugen.

Datenanalyse:

Nach Abschluss der Bibliothekssequenzierung werden die resultierenden Sequenzdaten an ein computergestütztes System übertragen für Bioinformatik Analyse. Der analytische Prozess umfasst sequenzielle Aktivitäten, einschließlich der Qualitätskontrolle von Sequenzen, der Ausrichtung von Sequenzen und der Identifizierung von Varianten. Während der Qualitätskontrollphase wird die ursprüngliche Sequenzdaten gefiltert, um Sequenzen niedriger Qualität auszuschließen. Anschließend können durch die Ausrichtung mit einem Referenzgenom oder einer Genomassemblierung die Quellen- und Positionsattribute der DNA-Sequenzen erkannt werden. Letztendlich ermöglichen Mechanismen wie die Variantenerkennung die Identifizierung genetischer Modifikationen innerhalb der Probe, wie z.B. Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) oder strukturelle Variationen (SVs), wodurch die genetischen Informationen, die für die DNA-Probe charakteristisch sind, offenbart werden.

Fazit

Fertige Bibliotheks-Sequenzierung spielt eine entscheidende Rolle in verschiedenen genomischen Studien. Es dient als Grundpfeiler in Genomsequenzierung, die eine schnelle Erfassung von hochwertigen Ganzgenomsequenzdaten ermöglicht und die genomische Forschung bei Menschen, Pflanzen, Tieren und anderen Organismen vorantreibt. In Transkriptom-Sequenzierung, vorgefertigte Bibliothekssequenzierung umfassend die Genexpressionsprofile entschlüsselt und Forschern hilft, die genetischen Regulationsmechanismen unter verschiedenen Bedingungen zu verstehen.

Darüber hinaus, vorgefertigte Bibliothekssequenzierung hat bedeutende Anwendungen in Epigenomik Forschung. Es wird verwendet, um epigenetische Marker wie DNA-Methylierung und Histonmodifikationen zu analysieren und das komplexe Netzwerk der Regulierung der Genexpression aufzudecken. Im Bereich der Genotypisierung und Variantenerkennung, vorgefertigte Bibliothekssequenzierung überzeugt durch die präzise Erkennung von Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) und strukturellen Variationen (SVs) und bietet entscheidende Datenunterstützung für personalisierte Medizin und Krankheitsforschung.

Zusammenfassend, vorgefertigte Bibliothekssequenzierung hebt sich als eine robuste und zeiteffiziente Methode zur Analyse von Genomen über verschiedene biologische Proben hervor. Der vereinfachte Arbeitsablauf, der mit der Konstruktion von DNA-Bibliotheken beginnt und in bioinformatischen Analysen endet, ermöglicht eine schnelle und präzise genomische Charakterisierung. Durch die Umgehung umfangreicher Probenvorbereitungsverfahren, vorgefertigte Bibliothekssequenzierung verringert experimentelle Abweichungen und reduziert den Ressourcenverbrauch.

CD Genomics bietet vorgefertigte Bibliothekssequenzierung Dienstleistungen, die Sequenzierungsplattformen mit unterschiedlichen Kapazitäten und Lese-längen nutzen, um vielfältige Forschungsbedürfnisse zu erfüllen. Darüber hinaus bieten wir eine umfangreiche Palette von Sequenzierungsdienstleistungen an, einschließlich Genomsequenzierung, Transkriptom-Sequenzierung, Epigenomik-Sequenzierungund GenotypisierungUnser Team aus erfahrenen Fachleuten ist darauf spezialisiert, außergewöhnliche Unterstützung und Hilfe zu bieten, um den Erfolg Ihrer Forschungsprojekte sicherzustellen.

Referenzen:

1. Hess JF, Kohl TA, Kotrová M, et al. Bibliotheksvorbereitung für die Next-Generation-Sequenzierung: eine Übersicht über Automatisierungsstrategien. Biotechnologische Fortschritte. 2020 1. Juli;41.
2. Head SR, Komori HK, LaMere SA, et al. Bibliothekskonstruktion für Next-Generation-Sequencing: Überblicke und Herausforderungen. BiotechnikenFeb 2014;56(2).
3. Robin JD, Ludlow AT, LaRanger R, et al. Vergleich von DNA-Quantifizierungsmethoden für die Next-Generation-Sequenzierung. Wissenschaftliche Berichte2016 Apr 6;6(1).