Phagenanzeige-Bibliotheks-Screening-Sequenzierung: Einführung, Arbeitsablauf und Anwendungen

Einführung in die Antikörper-Screening-Sequenzierung oder Phagen-Display-Bibliotheks-Screening

Phagen-Display ist ein beliebtes und effektives Laborwerkzeug zur Entdeckung von Peptiden, die an ein beliebiges Ziel binden. Diese Methode basiert typischerweise auf Phagenpartikelbibliotheken, die Millionen oder sogar Milliarden von exogenen Peptiden enthalten, die an Phagenoberflächenproteine gebunden sind. Die hochgradig vielfältige Bibliothek wird durch mehrere Auswahlrunden, auch bekannt als Biopanning, auf einige wenige Leads verkürzt, und eine Amplifikation ist erforderlich, um Phagenklone zu verstärken, die Peptide mit Zielbindung präsentieren, um die Binder mit hoher Affinität und Spezifität zu bewerten. Da Antikörperfragmente wie scFv oder Fab schnell exprimiert und auf Phagen angezeigt werden, spielt die Phagen-Display-Technologie eine entscheidende Rolle bei der Entdeckung und dem Engineering von Antikörpern.

Die Analyse von Peptidsequenzen in der Bibliothek ist entscheidend für die Phagenanzeige. Einzelne Phagenklone müssen für die konventionelle Sanger-Sequenzierung isoliert werden. Es handelt sich um einen zeitaufwändigen, kleinskaligen Prozess, der auf wiederholter Amplifikation beruht. Zu den Einschränkungen der Methode gehören die Erzeugung unbeabsichtigter selektiver Verzerrungen gegen bestimmte Antikörpersequenzen in Bakterien und die Unfähigkeit, mehr als hundert Bibliotheksklone zu bewerten.

Wenn es um die Analyse geht Phagen-Display-Screens, Illumina-DNA-Sequenzierung bietet viele Vorteile, insbesondere für große Sequenzsammlungen. Zum einen ermöglicht sie Phagen-Display-Experimente mit weniger und schließlich nur einer Auswahlrunde, wodurch potenzielle Probleme, die durch unerwünschte Verzerrungen und den Verlust der Diversität während des Amplifikationsprozesses verursacht werden, vermieden werden können. Dies ermöglicht die Entdeckung von Liganden, die zuvor verloren oder unterrepräsentiert in Phagen-Display-Screenings waren. Darüber hinaus können NGS-Plattformen bis zu 10 charakterisieren.⁶–10⁸ Sequenzen in einem einzigen Durchlauf, was eine viel repräsentativere und damit nützlichere Inhaltsabdeckung ermöglicht.

Abbildung 1. Eine Übersicht über den Phagenauswahlprozess. (Christiansen, 2015)

Allgemeiner Workflow für die Antikörper-Screening-Sequenzierung

Die grundlegenden Richtlinien für das Antikörper-Screening-Sequenzieren sind wie folgt:

- Durch die Verwendung verschiedener Trypsine wird das Antikörperprotein zunächst in überlappende Peptide verdaut.

- LC-MS/MS Verdau, gefolgt von der Optimierung der Fragmentierung

- De novo Peptidsequenzierung wird verwendet, um überlappende Peptide zu identifizieren.

- Automatisierte Antikörpersequenzzusammenstellung unter Verwendung von kategorisierten Peptiden

- Daten werden mithilfe modernster Rechenalgorithmen analysiert, um schnell die Aminosäuresequenz des verdauten Peptids zu bestimmen. Anwendungen des Antikörper-Screening-Sequenzierens.

Antikörperentdeckung durch Sequenzierung immunologischer Repertoires

Verschiedene Immunkompartimente aus unterschiedlichen Säugetierwirten wurden nach der Immunisierung untersucht, um neue monoklonale Antikörper mithilfe von Hochdurchsatzsequenzierung und bioinformatischer Bewertung zu finden. Drei verschiedene Methoden haben sich dabei als effektiv erwiesen.

Sequenzierung rekombinanter Antikörper-Repertoires

Ig-seq kann eingesetzt werden, um eine Vielzahl von rekombinanten Antikörperbibliotheken zu untersuchen, einschließlich naiver, fokussierter, immuner, semi-synthetischer und vollständig synthetischer Bibliotheken, sowie um direkt natürliche, von B-Zellen abgeleitete Antikörperrepertoires von Tieren und Menschen zu erschließen. In-vitro-Screening-Plattformen wie Phagen-, Hefe- und Ribosomendisplay sind mit diesen Repertoires geeignet. Eines der Hauptziele dieser Sequenzierungsbemühungen ist es, Bibliotheksqualitätsmetriken zu erfassen und abzuleiten, die die Wahrscheinlichkeit anzeigen, effektiv Antikörper mit bevorzugten Eigenschaften aus einer bereitgestellten rekombinanten Bibliothek zu isolieren.

Kombination von Hochdurchsatz-Screening und Sequenzierung zur Entdeckung und Entwicklung von monoklonalen Antikörpern

Um eine bedeutende, tiefgehende Perspektive auf mögliche antigen-spezifische Bibliotheksvarianten durch Hochdurchsatz-Sequenzierung zu bieten, muss die Vielfalt erheblich reduziert werden, um die volle Fähigkeit einer gegebenen natürlichen oder rekombinanten Antikörperbibliothek (in der Regel im Bereich von 10^6–10^11 Klonen) zu erhalten. Daher ist die Integration von Ig-seq mit einem phänotypbasierten Sequenzfilter und Selektionsdruck, wie sie durch Phagen- oder Hefedisplays bereitgestellt werden, eine praktikable Methode, um Antikörperbibliotheken selektiv und in der Tiefe zu untersuchen.

Referenzen:

1. Fischer N. Sequenzierung von Antikörper-Repertoires: die nächste Generation. InMAbs 2011, 1. Januar (Bd. 3, Nr. 1, S. 17-20). Taylor & Francis.
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