Langzeit-Sequenzierung zur Bewältigung der Haplotyp-Herausforderung in Lungenkrebs-Genomen

Die meisten bisher durchgeführten Studien zum Krebsgenom haben Kurzlese-Sequenzierung verwendet, die hauptsächlich die Identifizierung von kleineren genomischen Veränderungen wie einzelnen Nukleotidvarianten (SNVs) sowie kurzen Einfügungen und Löschungen (InDels) ermöglicht hat. Jüngste Fortschritte in den Sequenzierungstechnologien haben jedoch die Erkennung größerer genomischer struktureller Varianten (SVs) in verschiedenen Krebsarten ermöglicht. Diese SVs werden voraussichtlich eine bedeutende biologische und klinische Relevanz haben.

Strukturelle Varianten beinhalten erhebliche Umstellungen im Genom, wie chromosomale Inversionen und Translokationen. Diese Veränderungen können zu onkogenen Fusionsgenen führen, wie BCR-ABL, EML4-ALK und KIF5B-RET. Große Segmentlöschungen sind auch häufig in Tumorsuppressorgenen wie TP53, RB1 und PTEN, was zur Inaktivierung ihrer Expression und Funktion führt.

In Anerkennung der Bedeutung von SVs hat das Genome-Wide Pan-Cancer Analysis Konsortium den Fokus auf die Untersuchung großangelegter genomischer struktureller Variationen neben SNVs gelegt. Das Konsortium hat SV-Signaturen für 38 verschiedene Krebsuntertypen berichtet, mit dem Ziel, unser Verständnis dieser Veränderungen in verschiedenen Krebsarten zu erweitern.

Obwohl konventionelle Analysemethoden die Anwesenheit von SVs aus Kurzlese-Sequenzierungsdaten ableiten können, bieten sie oft nur unvollständige Informationen über die gesamte Struktur dieser Varianten. Um eine genauere und umfassendere Erkennung von SVs zu erreichen, sollten Langlese-Sequenzierungstechnologien eingesetzt werden. Langlese-Sequenzierung ermöglicht die Erzeugung erweiterter Reads, die eine direkte Beobachtung und präzise Charakterisierung komplexer struktureller Umstellungen im Krebsgenom ermöglichen.

Durch die Nutzung der Langlese-Sequenzierung können Forscher eine detailliertere und ganzheitlichere Sicht auf genomische strukturelle Varianten erhalten, was ein tieferes Verständnis ihrer funktionalen Implikationen und potenziellen klinischen Bedeutung in der Krebsforschung ermöglicht.

Genomische Haplotypanalyse von Lungenkrebs

Die Forschung verwendete eine genomische Haplotypanalyse, um nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom (NSCLC) bei 20 japanischen Patienten zu untersuchen. Sie nutzten sowohl Langlese- als auch Kurzlese-Whole-Genome-Sequenzierungsdaten (WGS), um eine gemeinsame Phasierungsanalyse durchzuführen.

Um einzelne Nukleotidpolymorphismen (SNPs) zu identifizieren, verglichen die Forscher die Daten der zweiten Generation mithilfe von BWA-MEM und GATK. Sie verwendeten minimap2, um die Langlesesequenzen zu vergleichen. Basierend auf den identifizierten SNPs führten sie eine Typisierung durch, um die Variabilität somatischer struktureller Variationen (SVs) und einzelner Nukleotidvariationen (SNVs) auf Haplotyp-Ebene zu erläutern.

Die Studie zeigte, dass die Haplotypisierung basierend auf SNP-Informationen erfolgreich war und etwa 56% der im normalen Genom detektierten SNPs Haplotypblöcken zugeordnet wurden. Die Sequenzierungstiefe wurde bewertet, und die Ergebnisse zeigten, dass der Aufbau von Haplotypen bei einer Tiefe von etwa 20x-30x zu saturieren schien, mit rund 5000 Konstrukten. Die Studie kam zu dem Schluss, dass Sequenzierungsdaten mit einer Mindesttiefe von 20x vernünftigerweise für die Tumorphasierungsanalyse verwendet werden könnten.

Um die Genauigkeit der Typisierungsergebnisse zu bewerten, untersuchten die Forscher speziell die Korrelation der für zwei gegebene SNPs erhaltenen Haplotypblöcke. Die Ergebnisse zeigten, dass die Differenzrate zwischen Tumor- und Normalgenomen für diese beiden SNPs ähnlich war wie frühere Ergebnisse, was auf eine angemessene Genauigkeit hinweist. Darüber hinaus waren 98,7% der SNP-SNP-Assoziationen konsistent, als die Typisierungsergebnisse mit denen einer anderen gesunden japanischen Kohorte verglichen wurden. Dies deutet darauf hin, dass die Phasierungsinformationen, die aus Tumor- und Normalgenomen gewonnen wurden, präzise sind und als Referenz für weitere Analysen genomischer Mutationen auf Haplotyp-Ebene dienen können.

Haplotypanalyse von 20 Krebsgenomen

Erstens wurde bei dem Vergleich der Haplotypblöcke von Tumoren mit denen von normalen Geweben beobachtet, dass die Tumor-Haplotypblöcke weniger zahlreich, aber in Bezug auf N50 (ein Maß für die Kontiguität) länger waren. Sie enthielten jedoch eine ähnliche Anzahl von einzelnen Nukleotidpolymorphismen (SNPs) im Vergleich zu normalen Geweben. Dies deutet darauf hin, dass die Tumorgenome größere und zusammenhängendere Haplotypblöcke aufwiesen, wahrscheinlich aufgrund der klonalen Expansion von Tumorzellen und des Verlusts der Heterozygotie in Krebsgenomen.

Zweitens wurde die Assoziation zwischen den sequenzierten Haplotypblöcken und der Sequenzierungstiefe oder der Read-Länge bewertet. Es wurde festgestellt, dass die Sequenzierungstiefe eine positive Korrelation mit der Länge der Phasenblöcke aufwies. Dies deutet darauf hin, dass eine höhere Sequenzierungstiefe die Wahrscheinlichkeit erhöht, längere Haplotypblöcke zu erhalten. Darüber hinaus wurde eine starke Korrelation zwischen der Länge einzelner Reads und der Länge der konstruierten Phasenblöcke festgestellt. Dies impliziert, dass die Länge einzelner Reads eine bedeutendere Rolle bei der Bestimmung der resultierenden Phasenblöcke spielt als die Sequenzierungstiefe.

Darüber hinaus wurde die präzise Erzeugung von Haplotypblöcken in allen 20 Fällen bewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass im Durchschnitt 78% der genomischen Regionen zu den phasierten Blöcken beitrugen. Dies deutet darauf hin, dass ein erheblicher Teil des Genoms genau phasiert werden konnte. Die verbleibenden 22% der phasierten Blöcke, die als Regionen mit geringer Abdeckung bezeichnet werden, konnten jedoch nicht ausreichend abgedeckt werden. Diese Regionen mit geringer Abdeckung waren hauptsächlich mit Regionen assoziiert, die durch niedrighäufige SNPs gekennzeichnet waren, was darauf hindeutet, dass das Vorhandensein von Regionen mit geringer Diversität oder homozygoten Regionen Herausforderungen für die genaue Haplotyp-Phasierung darstellt.

Insgesamt heben diese Ergebnisse den Einfluss der Sequenzierungstiefe und der Read-Länge auf die Erzeugung von Haplotypblöcken hervor und betonen den Einfluss der Tumoreigenschaften auf die Zusammensetzung und Kontiguität von Haplotypen in Krebsgenomen.