Next-Generation-Sequenzierung (NGS) vs. PCR

Was ist PCR?

PCR, kurz für Polymerase-Kettenreaktion, ist ein entscheidendes Werkzeug zur Erkennung bekannter Mutationen. Es funktioniert, indem es spezifische DNA-Fragmente identifiziert und so feststellt, ob ein Gen mutiert ist. Diese Technik ahmt den natürlichen Prozess der DNA-Replikation nach, jedoch in einer kontrollierten Laborumgebung. Im Laufe der Zeit hat sich PCR weiterentwickelt und verschiedene Varianten hervorgebracht, um unterschiedlichen Anwendungen gerecht zu werden.

Die erste Generation der PCR, bekannt als qualitative PCR, verwendet Standard-PCR-Geräte, um Zielgene zu amplifizieren. Die anschließende Analyse erfolgt durch Agarose-Gelelektrophorese, um das resultierende Produkt zu überprüfen.

Die zweite Generation bringt die fluoreszierende quantitative PCR (qPCR) voran. Diese Technik ermöglicht die Echtzeitüberwachung von Amplifikationsprodukten durch die Verwendung fluoreszierender Reagenzien. Trotz ihrer Fähigkeit zur relativen Quantifizierung mithilfe von Standardkurven reicht qPCR nicht aus, um eine absolute Quantifizierung bereitzustellen.

Ein weiterer bemerkenswerter Fortschritt ist das Mutation Amplification Blocking System (ARMS), das spezifische Primer nutzt, um mutierte Zielsequenzen präzise zu amplifizieren. In Kombination mit der Probenachweis- und Echtzeit-Fluoreszenz-quantitativen PCR ermöglicht ARMS die Erkennung seltener Mutationen mit erhöhter Spezifität und Sensitivität. Allerdings ist sein Anwendungsbereich auf bekannte Mutationsarten beschränkt, was bedeutet, dass es nicht in der Lage ist, neuartige Mutationen zu identifizieren.

Prinzipien und Verfahren der PCR

Der PCR-Prozess umfasst mehrere grundlegende Komponenten:

• DNA-Vorlage: Dies bezieht sich auf die Proben-DNA, die die Zielsequenz enthält.
• DNA-Polymerase: Wird verwendet, um einen neuen DNA-Strang zu synthetisieren, der komplementär zur Zielsequenz ist. Häufig verwendete Polymerasen sind Taq-DNA-Polymerase.
• Nukleotide: Dies sind die Bausteine, speziell Desoxyribonukleotidtriphosphate (dNTPs) (A/T/C/G), die für den Aufbau des neuen DNA-Strangs unerlässlich sind.
• Reverse Transkriptase: Bei der reversen Transkriptase-PCR (RT-PCR) ist die reverse Transkriptase entscheidend für die Umwandlung von RNA-Proben in komplementäre DNA (cDNA).

Sanger-Sequenzierung

Sanger-Sequenzierung hebt sich durch die Fähigkeit hervor, sowohl bekannte als auch unbekannte Mutationen direkt zu identifizieren, was es zu einem wertvollen Werkzeug in der genetischen Analyse macht. Allerdings ist seine Sensitivität bemerkenswert eingeschränkt, wenn es darum geht, Mutationen im EGFR-Gen zu erkennen.

Dieses Verfahren umfasst das sequenzielle Lesen der DNA-Basen über einen Abschnitt von etwa 800 Basenpaaren, was ihm den Status des Goldstandards sowohl in der traditionellen als auch in der Next-Generation-Sequenzierung verleiht. Bemerkenswerterweise spielte das Sanger-Sequenzieren eine entscheidende Rolle beim Abschluss des bahnbrechenden Humangenomprojekts, das über 13 Jahre dauerte.

In der Praxis beinhaltet das Sanger-Sequenzieren das Entwerfen von Primern, die auf Mutationsstellen innerhalb bekannter krankheitsassoziierter Gene abzielen, gefolgt von einer PCR-Amplifikation für die direkte Sequenzierung. Im Gegensatz zur umfassenden Exon-Amplifikation erfordert nur die spezifische Mutationsstelle oder ein angrenzender Teil des Exons eine Amplifikation. Trotz ihrer Nützlichkeit ist die Sensitivität des Sanger-Sequenzierens begrenzt; es kann Mutationen, die mit Frequenzen unter 5 % auftreten, möglicherweise nicht erkennen.

Nächste Generation Sequenzierung (NGS)

NGS oder Nächste Generation Sequenzierungbietet bemerkenswerte Erkundungskraft, indem sie aus einem einzigen DNA-Ausgangspunkt große Mengen an Daten generiert und somit eine höhere Probenverarbeitung ermöglicht. Diese DNA-Sequenzierungstechnologie, die auf PCR- und GeneChip-Methoden aufbaut, stellt einen bedeutenden Fortschritt gegenüber traditionellen Sequenzierungstechniken dar.

Während die Sequenzierung der ersten Generation synthetische Terminierungssequenzierung verwendete, führt NGS reversible Terminierungsenden ein, die eine gleichzeitige Sequenzierung mit der Synthese ermöglichen. NGS funktioniert, indem es spezifische Marker erfasst, typischerweise fluoreszierende molekulare Marker, die von neu hinzugefügten Basen während der DNA-Replikation getragen werden, um die DNA-Sequenz zu bestimmen.

Auch bekannt als Massively Parallel Sequencing (MPS) oder High-Throughput Sequencing (HTS), zeichnet sich NGS durch seine Skalierbarkeit, Geschwindigkeit und Zugänglichkeit bei der Analyse genomischer oder partieller Nukleinsäuresequenzen aus. Es hat die Fähigkeit, Millionen oder sogar Milliarden von DNA-Molekülen gleichzeitig zu sequenzieren und revolutioniert damit großangelegte Sequenzierungsprojekte.

NGS umfasst zwei Haupttypen: Kurzlese-Sequenzierung und Langzeit-SequenzierungDie Kurzlese-Sequenzierung, die sich durch ihre Reife in Genauigkeit und Kostenwirksamkeit auszeichnet, findet breite Anwendung in der Grundlagenforschung und klinischen Anwendungen. Im Gegensatz dazu adressiert die Langlese-Sequenzierung, die sich noch in der Optimierung von Genauigkeit und Kosten befindet, die Einschränkungen der Kurzlese-Sequenzierung bei der Erkennung struktureller Variationen in großen Fragmenten.

Die Vorteile von NGS umfassen die Fähigkeit, DNA durch nanoskalige PCR-Reaktionen zu amplifizieren, was zu einer massiven Datengenerierung durch parallele Reaktionen führt. Die sinkenden Kosten der Datengenerierung haben die großangelegte Gen-Sequenzierung demokratisiert, was die Forschung auf Bevölkerungsebene erleichtert und Anwendungen in der klinischen Diagnostik, der Wirkstoffentdeckung und der Verfolgung von Krankheitserregern verbessert.

Tabelle 1 NGS vs. PCR

Darüber hinaus Fortschritte wie Die SMRT-Technologie von PacBio und ONTs Nanoporen-Sequenzierung haben die NGS-Fähigkeiten erweitert. Die Technologie von PacBio ermöglicht die de novo-Assemblierung komplexer Arten und fördert Studien zur Biodiversität, während das Nanopore-Sequenzieren von ONT mit seinem PCR-unabhängigen Ansatz und langen Lese-längen von über 4 Mb die Erkennung struktureller Varianten verbessert. Tragbar NGS Geräte erweitern die Sequenzierungsanwendungen von Laboren zu Feldumgebungen und sogar ins All, wodurch der Umfang der genomischen Forschung und ihrer praktischen Anwendungen erweitert wird.

Auswahl zwischen NGS und qPCR: Faktoren und Überlegungen

Bestimmen, ob man nutzen soll NGS Die qPCR hängt von mehreren Faktoren ab, einschließlich der Stichprobengröße, dem Umfang der Sequenzen im Zielbereich, Budgetbeschränkungen und den Zielen der Studie. qPCR erweist sich typischerweise als vorteilhaft, wenn es um eine begrenzte Anzahl von Zielregionen (≤20) geht und wenn die Studie darauf abzielt, bekannte Varianten zu screenen oder zu identifizieren. Im Gegensatz dazu ist NGS in den meisten anderen Szenarien die bevorzugte Wahl.

Im Gegensatz zu traditionellen iterativen Testansätzen optimiert gezielte NGS die Prozesse, indem es die gleichzeitige Sequenzierung mehrerer Gene über zahlreiche Proben hinweg ermöglicht. Darüber hinaus, NGS bietet überlegene explorative Fähigkeiten und erleichtert die Entdeckung neuer Varianten. Daher ist es oft die bevorzugte Methode für Studien, die umfassendere genomische Einblicke oder großangelegte Sequenzierungsprojekte erfordern.