Langzeit-Sequenzierungsanwendungen in der Analyse komplexer Genome

Einführung: Warum Long-Read-Sequenzierung für komplexe Genome wichtig ist

In der Genomik führt Komplexität zu Mehrdeutigkeit. Viele Referenzgenome bleiben fragmentiert oder falsch zusammengesetzt in repetitiven oder GC-reichen Regionen – Stellen, an denen die Kurzlesesequenzierung regelmäßig versagt. Die heutige Langzeit-Sequenzierungstechnologien bieten einen Weg zur Behebung dieser blinden Flecken, der direkte Einblicke in strukturelle Variationen, phasierte Haplotypen und vollständige Transkripte ermöglicht, die zuvor unerreichbar waren.

Lange Reads (von mehreren zehn bis hin zu hunderten Kilobasen) bieten mehrere entscheidende Vorteile gegenüber Methoden mit kurzen Reads. Sie überbrücken sich wiederholende Elemente sowie große Einfügungen oder Löschungen in einem durchgehenden Abschnitt, wodurch die Mehrdeutigkeit bei der Ausrichtung und Assemblierung verringert wird (Amarasinghe et al., 2020). Sie vereinfachen auch die Variantenbestimmung in komplexen genomischen Loci, da weniger Unterbrechungen in der Kontinuität der Reads weniger falsche Splits oder Fehlverbindungen bedeuten. Infolgedessen können Projekte, die darauf abzielen, strukturelle Varianten zu erkennen oder Allele zu phasieren, oft eine viel größere Sensitivität und Spezifität mit langen Reads erzielen.

In nicht-klinischen Forschungszusammenhängen – wie funktioneller Genomik, evolutionären Studien oder der Entdeckung von Biopharma-Zielen – ist das Long-Read-Sequencing kein Nischenwerkzeug mehr. Es wird zunehmend unverzichtbar, um die Genomarchitektur vollständig zu charakterisieren, insbesondere bei Organismen mit großen oder polyploiden Genomen. Die neueren Chemien und Entwicklungen in der Bioinformatik haben die Basisgenauigkeit, den Durchsatz und die Kosten auf wettbewerbsfähige Niveaus angehoben (Wohlers et al., 2023). An diesem Wendepunkt müssen Forscher, die komplexe Genomanalysen planen, fragen: Wann sind Long Reads die richtige Wahl, und wie können sie die Auflösung liefern, die Short Reads nicht bieten können?

Für Leser, die neu in der genomweiten Methoden sind, können Sie die Grundlagen in Was ist die gesamte Genomsequenzierung??, was erklärt, wie die vollständige Genomabdeckung eine umfassende Entdeckung von Varianten ermöglicht.

Plattformvergleich: PacBio HiFi vs. Oxford Nanopore

Um die richtige Long-Read-Sequenzierungsstrategie auszuwählen, muss man die führenden Plattformen vergleichen—PacBio HiFi und Oxford Nanopore (ONT)—in Bezug auf Genauigkeit, Leselänge, Durchsatz und praktische Anwendbarkeit. Im Folgenden finden Sie einen ausgewogenen Vergleich, der auf begutachteter Literatur und technischen Benchmarks basiert.

2.1 Sequenzierungsprinzipien & Fehlerprofile

PacBio HiFi (SMRT + zirkuläre Konsenssequenzierung):

PacBio erzeugt mehrere Durchläufe um ein zirkularisiertes DNA-Fragment (SMRTbell) und bildet dann einen Konsens ("HiFi")-Lesewert mit sehr hoher Genauigkeit (oft >99 % pro Base).

Fehler sind tendenziell stochastisch (zufällige Substitutionen, Indels), was die Konsensbildung weitgehend unterdrücken kann.

Oxford Nanopore (Nanopore-Strommessung):

ONT-Sequenzen werden durch das Durchziehen eines Nukleinsäurestrangs durch ein Nanopore erzeugt, wobei Änderungen des ionischen Stroms gemessen werden, um die Basen abzuleiten.

Seine Fehler sind systematischer, insbesondere bei homopolymeren Läufen oder komplexen Stromverschiebungen. Die Chemie und die Basiserkennungsalgorithmen von ONT haben sich in den letzten Jahren jedoch dramatisch verbessert, wodurch die Fehlerquoten erheblich gesenkt wurden.

2.2 Lese-Länge, Durchsatz und Kontinuität

Leseumfang:

ONT kann routinemäßig ultra-lange Reads liefern, die unter optimalen Bedingungen manchmal 1 Mb überschreiten.

PacBio HiFi-Lesungen liegen typischerweise im Bereich von ≈ 10–25 kb und bieten eine ausgewogene Kombination aus Länge und Genauigkeit.

Durchsatz & Kontinuität:

In einer vergleichenden Studie mit einem Reisgenom erzeugten die ultra-langen Reads von ONT eine zusammenhängendere Assemblierung (18 Contigs, 10 Chromosomenebene) im Vergleich zu den HiFi-Reads von PacBio (394 Contigs, 3 Chromosomenebene).

Allerdings zeigen PacBio HiFi-Assemblierungen konsequent niedrigere Fehlerquoten auf Basisebene und weniger kleine Indels oder falsch zugeordnete Basen als ONT-Assemblierungen.

Abwägung:

Die Stärke von ONT bei der Überbrückung sehr langer Wiederholungen trägt dazu bei, Fragmentierung zu reduzieren und strukturelle Komplexität zu lösen, während die Stärke von PacBio in saubereren, basengenauen Assemblierungen mit weniger nachgelagerten Korrekturschritten liegt.

2.3 Genauigkeit und Variantenidentifizierung

Die hohe Basisgenauigkeit von PacBio HiFi macht es besonders geeignet für die Erkennung kleiner Varianten, präzise Bestimmung von strukturellen Varianten und zuverlässiges Phasieren.

ONT profitiert trotz geringerer inhärenter Genauigkeit von algorithmischer Fehlerkorrektur (z. B. Politur, neuronale Basisaufrufe) und verbesserter Chemie, um in vielen Kontexten eine wettbewerbsfähige Genauigkeit zu erreichen.

Für Anwendungen, bei denen die Präzision von Breakpoints wichtig ist (z. B. bei der Kartierung struktureller Varianten), kann die höhere Zuverlässigkeit von HiFi falsche Positive und mehrdeutige Grenzen reduzieren.

2.4 Praktische Überlegungen und Anwendungsfälle

Latenz / Echtzeit-Sequenzierung:

ONT bietet Echtzeit-Streaming-Daten an, was in Kontexten, die sofortiges Feedback erfordern, wie z. B. Feldversuchen oder dynamischen Stichprobenentscheidungen, von Vorteil ist.

Instrumentenkosten und Skalierbarkeit:

Die Plattformen von ONT haben niedrigere Einstiegskosten und eine modularere Skalierung (z. B. MinION oder PromethION) im Vergleich zu den Systemen von PacBio.

Komplexität der Bibliotheksvorbereitung:

Die Bibliotheksvorbereitung von PacBio, insbesondere für HiFi, ist anspruchsvoller in Bezug auf die DNA-Qualität und Größenbeschränkungen. ONT ist toleranter gegenüber längeren Fragmenten und nativen DNA/RNA-Modifikationen.

Transkriptomik & RNA-Sequenzierung:

Vergleichende Studien (LRGASP-Konsortium, Pardo-Palacios et al. 2023) zeigen, dass PacBio Iso-Seq oft mehr vollständige Isoformen und mehr Gene bei niedrigeren Lesetiefen im Vergleich zu ONT-Daten erfasst.

ONT hat Stärken in Durchsatz und Flexibilität für RNA-Sequenzierung, leidet jedoch manchmal unter stärkerer 5′/3′-Truncation und artefaktischen monoexonischen Reads.

Leseempfehlung

PacBio vs Oxford Nanopore: Welche Langzeit-Sequenzierungstechnologie ist die richtige für Ihre Forschung?

Abbildung 1: Kontiguität der ONT- und PacBio-Assemblierungen.

Erkennung von strukturellen Varianten

Strukturelle Varianten (SVs) – Insertionen, Deletionen, Inversionen, Duplikationen, Translokationen und komplexe Umstellungen (≥ 50 bp) – gehören zu den folgenschwersten Formen der Genomvariation. Langzeit-Sequenzierung eröffnet einen Einblick in diese Ereignisse, die bei kurzen Reads oft übersehen werden. Im Folgenden beschreibe ich, wie Langreads die SV-Erkennung verbessern, die verwendeten algorithmischen Strategien, praktische Überlegungen und reale Beispiele, die die Stärken (und Fallstricke) dieses Ansatzes veranschaulichen.

3.1 Warum die Erkennung struktureller Varianten von langen Reads profitiert

Span volle Breakpoints und flankierenden Kontext.

Da lange Reads über das gesamte Variantenlokus und seine flankierenden einzigartigen Sequenzen hinausgehen können, ermöglichen sie eine direkte Ausrichtung über Insertionen oder Deletionsübergänge hinweg – selbst in repetitiven Regionen. Dies verbessert die Auflösung der Bruchpunkte erheblich und reduziert mehrdeutige Zuordnungen.

Komplexe Ereignisse lösen.

Lange Reads können geschachtelte oder zusammengesetzte strukturelle Varianten (z. B. Insertion + Inversion, Translokationen, die an Duplikationen angrenzen) in einem einzigen Molekül erfassen. Kurze Reads, die über Grenzen fragmentiert sind, neigen dazu, diese Ereignisse entweder zu fragmentieren oder ganz zu übersehen.

Neuartige Sequenzinsertationen erkennen.

Eingefügte Sequenzen, die im Referenzgenom fehlen, sind problematisch für kurze Reads. Lange Reads können neuartige Einsätze von Anfang bis Ende tragen, was die entwicklungsgestützte Entdeckung zuvor nicht kartierter Sequenzen ermöglicht.

Besser in sich wiederholenden oder wenig komplexen Bereichen.

Viele SVs treten in segmentalen Duplikationen, Tandemwiederholungen oder Regionen mit niedriger Komplexität auf. Durch das Überbrücken von Wiederholungen verringern lange Reads die mehrdeutige Zuordnung und Fehlzuweisung von Variantensignalen.

Diese Stärken wurden in Benchmarking- und empirischen Studien bestätigt: Long-Read-Strategien entdecken Tausende von SVs, die von Short-Read-Ansätzen übersehen werden (Dierckxsens et al., 2021).

Abbildung 2: Strategien für strukturelle Varianten basierend auf drei HiFi

3.2 Algorithmische Strategien: Lese-basierte vs. Zusammenbau-basierte SV-Erkennung

Es gibt zwei grundlegende rechnerische Ansätze zur Ableitung von SVs aus Langlesedaten: lesebasiert und baukastenbasiertJede hat ihre Stärken und Kompromisse (Lin et al., 2023).

Wichtige Beobachtungen aus den Benchmarks:

• Bis zu ~80 % der SVs sind zwischen read- und assembly-basierten Strategien in standardisierten menschlichen Datensätzen kongruent, insbesondere bei Insertionen/Deletionen in nicht-repetitiven Zonen.
• Diskrepanzen treten häufig bei Inversionen oder sehr großen Umstellungen in komplexen Loci auf, wo die Ausrichtungsambiguität oder fehlerhafte Verknüpfungen zwischen den Ansätzen variieren.
• Lesebasierte Strategien erreichen eine angemessene Rückrufrate (≈ 77 %) bei niedriger (5×) Abdeckung, während assemblierungsbasierte Methoden etwa 20× oder mehr benötigen, um eine ähnliche Sensitivität zu erreichen.
• Viele Werkzeug-Pipelines "vereinigen" jetzt Aufrufe von read- und assemblierungsbasierten Methoden, um Sensitivität und Präzision zu maximieren.

Somit liefert eine integrative Pipeline, die beide Strategien nutzt (insbesondere bei wertvollen, komplexen Genomprojekten), oft das umfassendste SV-Callset.

Um zu entscheiden, ob Ihr Projekt zu strukturellen Varianten eine Vollgenom- oder gezielte Abdeckung erfordert, lesen Sie unseren Vergleichsartikel. Whole Genome vs. Targeted Sequenzierung: Für was sollten Sie sich entscheiden?.

3.3 Häufig verwendete Long-Read-SV-Caller und aktuelle Fortschritte

In den letzten zehn Jahren sind viele Long-Read-SV-Caller entstanden, die verschiedene Heuristiken oder Verbesserungen durch maschinelles Lernen verwenden (Ahsan et al., 2023). Naturmethodens) . Zu den am häufigsten verwendeten gehören:

• Sniffles / Sniffles2 – Ein robustes, lesebasiertes Tool, das Split-Read- und ergänzende Ausrichtungsmerkmale erkennt und häufig als Benchmark verwendet wird.
• cuteSV – Betont die Clusterbildung von Signatur-Signalen und die Verfeinerung von Bruchpunkten.
• SVIM – Modularer Sammler von Intra- und Inter-Lese-Signalen für mehrere SV-Typen.
• pbsv – PacBios natives SV-Analyse-Tool, optimiert für HiFi-Datensätze.
• PAV, SVIM-ASM – Auf Assemblierung basierende Aufrufer, die Contig-Referenz-Ausrichtungen analysieren, um strukturelle Unterschiede zu identifizieren.

Jüngste Fortschritte umfassen die Integration von tiefes Lernen um Fehlalarme zu reduzieren und komplexe Signale besser zu modellieren:

• SVHunter (transformer-basiert) hat auf verschiedenen Plattformen reduzierte Falsch-Entdeckungsraten gezeigt, indem es globale Ausrichtungsmuster modelliert hat.
• cnnLSV kodiert Ausrichtungsnachbarschaften in Bilder, verwendet CNNs, um SV-Anrufe zu filtern und zu verfeinern, und zeigt eine verbesserte Leistung über SV-Typen hinweg.
• Ausrichtungsverbesserungen, z.B. HQAlign für Nanopore-Daten, verbessern die Präzision von Breakpoints, indem sie Fehlerverzerrungen auf dem Stromniveau von Nanoporen modellieren (Joshi et al.).

Bei der Gestaltung einer Pipeline kann man mehrere Werkzeuge kombinieren und dann Filterung, Konsenszusammenführung oder Validierung durchführen, um die Genauigkeit zu erhöhen.

3.4 Beste Praktiken & praktische Überlegungen

Um die SV-Erkennung robust in realen Projekten einzusetzen, beachten Sie Folgendes:

Abdeckungs- und Lese-Längen-Kompromiss

Benchmarking legt nahe, dass eine Abdeckung von etwa 20× mit einer durchschnittlichen Lese-Länge von etwa 20 kb und einer Fehlerquote von ≤1 % gute Ergebnisse für viele SV-Caller liefert.

Darüber hinaus erreichen die Gewinne bei der Rückrufquote ein Plateau, während die Kosten weiterhin steigen.

Die Wahl des Aligners ist wichtig.

Werkzeuge wie minimap2, ngmlr und lra zeigen unterschiedliche Sensitivitäten. Fehlanpassungen/Fehlübereinstimmungen können falsche SV-Signaturen erzeugen (Lin et al. 2023).

Spezialisierte Aligners wie HQAlign helfen, nanopore-spezifische Fehlermodi zu mindern (Joshi et al.).

Niedrigkomplexe / sich wiederholende Regionen bleiben eine Herausforderung.

Jüngste Arbeiten zeigen, dass obwohl Regionen mit niedriger Komplexität etwa 1–2 % des Genoms ausmachen, sie einen überproportionalen Anteil an SV-Fehlern enthalten – 77–91 % der Fehlaufrufe treten in solchen Regionen auf.

Falsch-positive Ergebnisse und Filterung

Hochdichte Daten und Ausgaben mehrerer Werkzeuge neigen dazu, falsch-positive Ergebnisse zu erhöhen. Zusammenführung, Konsens zwischen den Werkzeugen, Validierung auf Leseebene und manuelle Kuratierung helfen, dies zu mindern.

Validierung und orthogonale Bestätigung

Wo immer möglich, bestätigen Sie wichtige SVs (insbesondere neuartige oder hochgradige) mit orthogonalen Methoden – PCR, optische Kartierung oder gezielte ultralange Sequenzierung.

3.5 Beispielanwendungsfall: Krebsgenomumstellungen

Ein überzeugendes Beispiel ergibt sich aus der Anwendung von Langzeit-Sequenzierung auf Krebsgenome, bei denen strukturelle Variationen (SVs) die Onkogenese durch Fusionsereignisse, komplexe Umstellungen oder Änderungen der Kopienzahl vorantreiben können.

In einer Studie entdeckte das Langzeit-Sequencing mehrere Chromothripsis-Ereignisse und zusammengesetzte Translokationen in Tumorproben, die in Kurzzeitdaten fragmentiert oder fehlinterpretiert wurden.Überprüfung der "Anwendung von Langzeit-Sequenzierung zur Erkennung struktureller Varianten"").

In einer anderen Anwendung ermöglichte die Kombination von SV-Calling mit phasierten Langreads die Rekonstruktion von allelspezifischen Umstellungen, was half, treibende von passagierenden Ereignissen in heterogenen Tumormustern zu entwirren.

Diese Erfolge in der realen Welt verdeutlichen, wie die Erkennung von langen Lesefragmenten biologisches Wissen vermittelt, anstatt nur Variantenkataloge zu erstellen.

Haplotyp-Phasierung und allelspezifische Analyse

Phasierung – die Zuordnung von Varianten zu ihrem elterlichen Chromosomenkopie – ist entscheidend für die Interpretation von cis- versus trans-genetischen Effekten. Langzeit-Sequenzierung ermöglicht eine direktere und umfassendere Phasierung als kurze Reads und eröffnet allelspezifische Analysen von Expression, Methylierung oder Varianteninteraktionen. Im Folgenden beschreibe ich, wie Langreads die Phasierung verbessern, algorithmische Strategien, Fallstricke, die es zu vermeiden gilt, und reale Beispiele, die den Einfluss in der Forschung demonstrieren.

4.1 Warum Phasierung wichtig ist: cis/trans-Unterscheidung und allelspezifische Regulation

Cis vs. trans Interpretation

Viele funktionale Fragen hängen davon ab, ob zwei Varianten auf demselben Chromosom (cis) oder auf entgegengesetzten (trans) liegen. Zum Beispiel können zwei regulatorische Varianten in cis synergistisch wirken, während ihre Effekte in trans sich gegenseitig aufheben oder anders interagieren könnten.

Allelspezifische Expression (ASE) und Regulation

Die Phasierung von RNA-Reads zu Haplotypen ermöglicht die Quantifizierung der allelspezifischen Expression oder Spleißung. Dies ist entscheidend für das Verständnis von Imprinting, der Effektgrößen regulatorischer Varianten oder des allelischen Ungleichgewichts als Reaktion auf eine Behandlung.

Kombinierte Heterozygotie und Dosiseffekte

In Forschungskontexten, die Kombinationen von Varianten untersuchen, hilft das Phasing festzustellen, ob schädliche Allele auf demselben Haplotyp oder auf unterschiedlichen vorkommen – eine Nuance mit Auswirkungen auf die funktionale Modellierung.

Auflösung von allelspezifischer Methylierung und epigenetischen Zuständen

Neue Methoden (z. B. MethPhaser) nutzen Methylierungsmuster in langen Reads, um Phasierungsblöcke über SNVs hinaus zu erweitern und den epigenetischen Zustand in die Haplotypauflösung zu integrieren (Fu et al., 2024). Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von externen Links übersetzen. Bitte geben Sie den Text, den Sie übersetzen möchten, direkt hier ein.).

Somit bietet robustes Phasing eine tiefere Einsicht über Variantenkataloge hinaus.

4.2 Phasierungsstrategien mit langen Reads: read-basierte, assemblierungsbasierte und hybride Ansätze

Ähnlich wie bei der SV-Erkennung verwendet das Phasing mit langen Reads mehrere rechnerische Strategien. Im Folgenden finden Sie einen Vergleich typischer Ansätze und ihrer Vor- und Nachteile:

Benchmarking zeigt, dass lange Reads bei ~25–30× Abdeckung die Phasierung von >95 % der heterozygoten SNVs in lange Blöcke ermöglichen (Zhao et al., 2025. doi: 10.1093/nar/gkaf247) (für Bulk-Sequenzierung). Die Integration von Eltern- oder Stammbaumdaten reduziert zusätzlich die Switch-Fehler.

Darüber hinaus ermöglichen in der modernen Einzelzell- oder Gamet-Sequenzierung lange Reads eine chromosomenweite Phasierung sowohl von SNVs als auch von strukturellen Varianten. Zum Beispiel erreichten Xie et al. (2023) eine Genauigkeit von ~98,6 % bei der Phasierung von SVs über Spermiengenome mithilfe von Langzeit-Sequenzierung (doi: 10.1093/nar/gkad532).

4.3 Häufige Fallstricke und Überlegungen beim Haplotype-Phasing

Während Long-Reads leistungsstarke Phasierungsfähigkeiten bieten, müssen mehrere Vorbehalte berücksichtigt werden:

Fehlerbedingte Phasenfehler

Hohe Fehlerquoten (insbesondere bei älteren ONT-Chemien) können falsche Allele einführen, was zu Switch- oder Flip-Fehlern führt. Eine Senkung der Basisaufruf-Fehler und das Polieren helfen, dies zu mildern.

PCR-Chimärenartefakte in ampliconbasierten Ansätzen

Amplifikationsbasierte Strategien können chimäre Reads erzeugen, die das Phasieren irreführen. Laver et al. (2016) zeigten spurious Haplotypen beim Phasieren von weit auseinanderliegenden Varianten aufgrund von Chimären (DOI:10.1038/srep21746).

Sparse Heterozygotie bricht Blöcke

Regionen mit niedriger Varianten-Dichte (wie lange homozygote Abschnitte) können das Phasing unterbrechen, es sei denn, sie werden durch ultralange Reads oder ergänzende Daten (z. B. Hi-C) überbrückt.

Ausrichtungsbias und Referenzallelbias

Reads können in mehrdeutigen Kontexten, insbesondere in der Nähe von Indels oder Wiederholungen, bevorzugt an Referenzallele ausgerichtet sein. Dies kann die Zuordnung von Phasierungen verzerren.

Schaltfehler in MEC-basierten Methoden

Einige Haplotype-Assemblierungsalgorithmen basieren auf Minimum Error Correction (MEC)-Modellen. Bei rauschbehafteten Langlesedaten kann das MEC-Optimum möglicherweise nicht mit den tatsächlichen Haplotypen übereinstimmen; Simulationsstudien zeigten fehlerhafte Haplotypen bei geringeren Abdeckungen (Majidian et al., 2018).

Minderungsstrategien umfassen:

• Verwendung der Dual-Strategie-Phasierung (Lesen + Zusammenstellung)
• Filtern von Variantenaufrufen mit niedriger Zuversicht
• Post-hoc Wechselkorrektur
• Integration von orthogonalen Verknüpfungsdaten (z. B. Hi-C, Strand-seq)

4.4 Forschungsanwendungsfälle: schrittweise Einführung der Populationsgenomik und regulatorischer Studien

Einzel-Spermien-Phasierung von SVs und SNVs

Xie et al. wendeten Long-Read-Sequenzierung auf einzelne Spermien an, um haplotypische Chromosomen im Maßstab zu entschlüsseln und strukturelle Varianten mit einer Genauigkeit von etwa 98,6 % zu phasieren (DOI:10.1093/nar/gkad532). Diese Methode ermöglicht eine direkte Phasierung ohne elterliche Daten und bietet ein Modell für Keimbahnstudien.

Gleichzeitige Haplotypisierung und Einzelzell-Variantenerkennung

Zhao et al. verwendeten Long-Read-Whole-Genome-Sequenzierung in Einzelzellen, um SNVs, Indels, SVs und Phasenvarianten gleichzeitig zu identifizieren. Sie erreichten eine Phasengenauigkeit von 92–98 % im großen Maßstab (Zhao et al., 2025. oi: 10.1093/nar/gkaf247).

Methylierungsunterstützte Erweiterung von Phasenblöcken

Fu et al. integrierten das Methylierungssignal in die ONT-Phasierung über MethPhaser, wodurch die Phasenblocklänge (N50) um 78-151 % erhöht und die Phasierung in Regionen mit niedriger Variabilität ausgeweitet wurde (Fu et al., 2024).

In all diesen Fällen wechselten die Forscher von Variantenkatalogen zu allelspezifischen Kontexten, die die Interpretation von regulatorischen Variationen, epigenomischen Unterschieden und cis-Effekten leiten.

Vollständiges Transkript und Isoformanalyse

Die Langzeit-Sequenzierung hat die Transkriptomik revolutioniert, indem sie die direkte Sequenzierung intakter RNA-Moleküle von Ende zu Ende ermöglicht. Diese Fähigkeit eröffnet eine genauere Entdeckung von Isoformen, Quantifizierung und Einblicke in die Transkriptvielfalt, die mit kurzen Reads selten erreicht werden. Im Folgenden erkläre ich, wie die Voll-Längen-Transkript-Sequenzierung funktioniert, Strategien und Fallstricke sowie praktische Anwendungen, die ihren Wert in der Forschung zeigen.

5.1 Warum die Sequenzierung von Voll-Längen-Transkripten wichtig ist

Vermeidet Montageambiguität

Kurze RNA-Daten müssen rechnerisch zu Transkripten zusammengesetzt werden, was häufig zu Fehlzuweisungen zwischen Isoformen führt, die Exons teilen. Lange Reads können gesamte Spleißformen abdecken und beseitigen diese Mehrdeutigkeit (Santucci et al., 2024. DOI:10.1093/bfgp/elae031).

Entdeckt neuartige und komplexe Isoformen

Lange Lesungen identifizieren zuvor nicht annotierte Spleißvarianten, Intronretention, alternative Promoternutzung und Fusionstranskripte zuverlässiger (Benchmarking von Nature Methods).

Verbesserte Isoformquantifizierung

Da gesamte Transkriptmoleküle beobachtet werden, wird die Zuordnung zu Isoformen genauer. Werkzeuge wie LIQA gewichten jedes Read nach Qualität und Länge, um die Schätzungen der Häufigkeit zu verbessern. (Hu et al., 2021).

Unterstützt allelspezifische Transkriptexpression und Spleißung

Wenn sie mit Phasierungsdaten kombiniert werden, können vollständige Lesevorgänge Splicing-Variationen mit Haplotypen verknüpfen und damit allelspezifische Isoformregulation aufdecken.

5.2 Strategien und Werkzeugauswahl: Arbeitsablauf & Herausforderungen

Bibliotheksvorbereitung und Protokolloptionen

• cDNA vs direkte RNA

Viele Workflows konvertieren RNA → cDNA und amplifizieren, was den Durchsatz erhöht, aber Bias oder Truncation einführen kann. Die direkte RNA-Sequenzierung (z. B. ONT) vermeidet Artefakte der reversen Transkription und kann RNA-Modifikationen bewahren, hat jedoch einen niedrigeren Durchsatz und mehr 3′-Bias.

• Vollständige Auswahl und Größenfraktionierung

Die Auswahl von vollständigen Transkripten (z. B. durch Cap-Selektion oder Poly(A)-Schwanzstrategien) trägt dazu bei, die Wiederherstellung vollständiger Isoformen zu maximieren und Fragmente zu minimieren.

Rechnerische Pipeline- und Werkzeugstrategien

• Lesenausrichtung und splicing-bewusste Zuordnung

Aligner wie minimap2, deSALT oder FLAMES sind auf die Ausrichtung von langen, gespleißten Reads abgestimmt. Eine genaue Erkennung von Spleißstellen ist entscheidend für die Identifizierung von Isoformen.

• Isoform-Klusterung und -Zusammenführung

Viele Reads repräsentieren dasselbe Isoform. Cluster- (Zusammenführungs-) Werkzeuge wie die Iso-Seq-Pipeline (PacBio's ICE/CCS/Polish), IsoQuant oder FLAMES gruppieren Reads in Transkriptmodelle (IsoQuant ist eine neuere Option).

• Transkriptquantifizierung und Bias-Korrektur

Werkzeuge wie LIQA weisen Lesevorgängen Gewichte zu, basierend auf Fehler- und Trunkierungsverzerrungen. Einige Methoden verwenden EM-Algorithmen, um die Isoformzählungen zu verfeinern (z. B. LIQA).

• Validierung und Filterung von Artefakten

Spurious Isoformen können durch Fehlanpassung, Templatewechsel oder partielle Reads entstehen. Strenge Filterung und Konsistenzprüfungen zwischen den Proben helfen, echte Isoformen zu validieren.

• Benchmarking und Konsensbildung

Das LRGASP / LR-RNA-Seq Benchmark-Konsortium hat Dutzende von Methoden bewertet und festgestellt, dass die Genauigkeit von der Balance zwischen Lese- länge, Fehlerquote und Abdeckung abhängt. (LRGASP, 2024).

5.3 Fallstricke und praktische Überlegungen

Lesen von Trunkierung / 5′- oder 3′-Bias

Einige Reads können abgeschnitten sein (insbesondere bei ONT Direct RNA), was die Isoformzählungen in Richtung kürzerer oder partieller Transkripte verzerren kann. Benchmarking zeigt, dass PCR-amplifizierte cDNA- und IsoSeq-Ansätze tendenziell eine gleichmäßigere Abdeckung über die Transkriptlängen hinweg bieten.

Fehlerbedingte Spleißfehler

Sequenzfehler in der Nähe von Spleißjunctions können zu falschen neuartigen Spleißstellen führen. Polishing und Konsens-Clusterung helfen, dies zu mildern.

Niedrig exprimierte Transkripte und Rauschen

Seltene Isoformen können durch wenige Reads repräsentiert werden, was sie anfällig für falsch-positive Ergebnisse macht. Replikatdaten und Konsistenzfilter sind wichtig.

Komplexe Loci mit überlappenden Isoformen

Gene mit vielen Spleißvarianten oder geschachtelten Transkripten bleiben eine Herausforderung, insbesondere in Arten ohne hochwertige Referenzannotation.

Referenzbias bei der Entdeckung von Neuheiten

Bei der Verwendung eines referenzgesteuerten Modells können tatsächlich neuartige Isoformen, die in der Annotation fehlen, übersehen oder falsch ausgerichtet werden. Die Abhängigkeiten zur Entdeckung von de novo-Isoformen variieren zwischen den Werkzeugen (LRGASP-Ergebnisse).

5.4 Anwendungsbeispiele: Isoformvielfalt und regulatorische Einblicke

AML-Transkriptom-Diversität

Bei der akuten myeloischen Leukämie verwendeten Shi et al. Long-Read-Sequenzierung, um über 119.000 zuvor nicht annotierte Transkripte zu entdecken. Isoform-spezifische Profile definierten molekulare Subtypen und zeigten die Vielfalt regulatorischer RNAs auf (Shi et al. 2025. DOI:10.1016/j.xcrm.2025.101057).

Isoform-spezifische eQTL (ieQTL) Kartierung

Eine Studie zu 67 B-Zell-Linien wandte die Oxford Nanopore Voll-Längen-RNA-Sequenzierung an, um isoform-spezifische QTLs (ieQTLs) im Bevölkerungszusammenhang zu identifizieren. Viele ieQTLs waren durch Kurzleseansätze übersehen worden.

Benchmarking-Transkriptprotokolle

Das SG-NEx-Projekt hat mehrere Long-Read-RNA-Protokolle an menschlichen Zelllinien bewertet und gezeigt, dass Long-Read-Daten Hauptisoformen robuster identifizieren und Fusionsereignisse oder neuartige Transkripte besser erkennen als Short-Read-Methoden.

Diese Beispiele verdeutlichen, wie die Sequenzierung von Volltranskripten das Verständnis der Transkriptionskomplexität, der Regulierung alternativer Spleißvorgänge und der Entdeckung funktioneller Isoformen in der Systembiologie und der Forschung und Entwicklung vertieft.

Für Forscher, die die Quantifizierung von Transkripten und die Optimierung der Abdeckung untersuchen, unser Leitfaden Tiefe Sequenzierung: Wenn Tiefe Entdeckung bedeutet diskutiert, wie die Sequenzierungstiefe die Erkennung seltener Isoformen beeinflusst.

Wann man Long-Read-Sequenzierung verwenden sollte

Entscheidung treffen wann In in die Langzeit-Sequenzierung zu investieren, ist ebenso entscheidend wie das Verständnis. wie um es zu nutzen. In diesem Abschnitt gebe ich Richtlinien und Entscheidungskriterien an, um Forschern – wie in CROs, Pharma-F&E oder akademischen Laboren – zu helfen, zu bewerten, ob Langreads das richtige Werkzeug für ihre Projektziele sind.

6.1 Entscheidungsmerkmale: Projektziele, Genomkomplexität und Variantenarten

Bei der Bewertung der Eignung sollten Sie diese Kernfaktoren berücksichtigen:

Zielvariantenarten und Auflösungsanforderungen

Wenn Ihre Studie darauf abzielt, strukturelle Varianten, neuartige Einsprengungen, komplexe Umstellungen zu erkennen oder präzise Bruchpunktgrenzen benötigt, bieten lange Reads einen erheblichen Vorteil gegenüber Methoden mit kurzen Reads.

Phasierung, allelspezifische Komplexität oder Haplotypauflösung

Wenn Sie Varianten Haplotypen zuordnen, allele-spezifische Expression/Splicing untersuchen oder cis-regulatorische Effekte verstehen müssen, sind lange Reads oft unerlässlich.

Genomarchitektur und Repetitivität

In Organismen mit stark repetitiven, GC-reichen oder polyploiden Genomen (Pflanzen, Pilze, große Genome) helfen lange Reads, Mehrdeutigkeiten zu klären und die Fragmentierung der Assemblierung zu reduzieren.

Neuartige oder referenzarme Genome

Für de-novo-Assemblierungen oder schlecht annotierte Arten erhöhen lange Reads die Kontinuität, reduzieren Lücken und vereinfachen die strukturelle Interpretation.

Transkriptomkomplexität

Wenn Ihr Ziel darin besteht, vollständige Isoformen, Fusionsgene, chimäre Transkripte oder Spleißvarianten zu kartieren, bietet die Langzeit-RNA-Sequenzierung Möglichkeiten, die kurze Reads nicht liefern können.

Kosten, Durchsatz und Probenbeschränkungen

Wenn Ihr Projekt eine ultra-hohe Tiefe (>100×) erfordert oder viele Proben enthält, könnten Kosten pro Basis und Durchsatz kurze Reads oder hybride Strategien begünstigen. Auch die DNA-Qualität der Proben (Fragmentierung, Eingabemasse) kann einschränken, was bei der Vorbereitung von Long-Read-Bibliotheken machbar ist.

6.2 Faustregel-Entscheidungsmatrix

Unten finden Sie eine vereinfachte Entscheidungstabelle zur Unterstützung der Technologieauswahl:

Wenn Ihr Ziel mit ≥ 2 "Langzeitlese" Einträgen übereinstimmt, ist eine Langzeitlese-Sequenzierung wahrscheinlich gerechtfertigt.

6.3 Typische Abdeckungs- und Lese-Längen-Schwellenwerte für eine effektive Nutzung

Von Benchmarking und empirischer Praxis:

Abdeckung

Eine Abdeckung von ~15-25× ist oft ausreichend für eine robuste Erkennung struktureller Varianten und moderate Phasierung. Für hochkomplexe Genome kann >30× vorzuziehen sein.

Längenverteilung der Reads

Mittlere Lese-längen von 15–25 kb oder mehr helfen, viele Wiederholungen zu überbrücken. Ultra-lange Reads (>100 kb) ermöglichen zudem das Überbrücken von Zentromeren oder extrem langen tandemartigen Anordnungen.

Qualität / Fehlerquote

Plattformen mit hoher Basisgenauigkeit (z. B. PacBio HiFi) verringern den Bedarf an tiefem Polieren. Fehlerkorrigierte oder konsensbasierte Reads verbessern die Sensitivität und Spezifität.

Diese Schwellenwerte stammen aus vergleichenden Studien (z. B. LRGASP-Benchmarking) und der Praxis vor Ort.

6.4 Anwendungsfall-Szenarien, die veranschaulichen, "warum Long-Read geeignet ist"

Hier sind konkrete Szenarien, in denen das Long-Read-Sequencing die klare Wahl ist:

Genom-Editing-Qualitätssicherung und Off-Target-Erkennung

Nach der CRISPR-Bearbeitung können PCR oder gezielte Kurzlesungen unerwartete große Einfügungen, Löschungen oder Umstellungen übersehen. Mit Hilfe von Langzeit-Sequenzierung haben Wissenschaftler unvorhergesehene Änderungen entdeckt – wie 1–2 kb große Einfügungen oder komplexe Umstellungen –, die unsichtbar bleiben würden.

De novo Zusammenstellung eines polyploiden Pflanzengenoms

In Pflanzen mit mehreren homologen Chromosomen und repetitiven Inhalten reduzieren lange Reads die Unsicherheit bei der Scaffolding, schließen Lücken und unterscheiden homologe Chromosomensegmente.

Vollständige Isoform-Kartierung in einem Krankheitsmodell

Wenn alternatives Spleißen oder Fusionstranskripte zentral für mechanistische Hypothesen sind, können kurze Reads Exons/Introns falsch zuordnen. Lange Reads erfassen gesamte Transkriptmoleküle von Ende zu Ende und ermöglichen sicherere Isoformzuweisungen.

Explorative Genomik von Nicht-Modellarten

Für einen neu untersuchten Organismus ohne Referenz beschleunigen lange Reads die Erstellung eines zusammenhängenden Genoms und zeigen von Anfang an strukturelle Variationen auf.

6.5 Wann nicht Langzeit-Sequenzierung priorisieren

Es gibt Szenarien, in denen lange Reads möglicherweise nicht genügend Vorteile für die zusätzlichen Kosten oder die Komplexität bieten:

• Wenn die wichtigsten Varianten von Interesse Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) oder kleine Indels in nicht-repetitiven Regionen sind, können gut abgedeckte kurze Reads ausreichen.
• Studien, die eine ultra-tiefe Abdeckung über viele Proben hinweg benötigen (z. B. bevölkerungsweite SNP-Screenings), bei denen die Kosten pro Basenpaar begrenzend sind.
• Wenn die Eingangs-DNA stark degradiert oder die Ausbeute gering ist, können Einschränkungen eine Vorbereitung von Langlese-Bibliotheken ausschließen.
• Projekte, die bereits gut durch hybride oder integrierte Ansätze mit validierten Pipelines bedient werden.

Wie lange Reads die Qualität der Genomassemblierung verbessern

Genauere, zusammenhängende Genomassemblierungen sind grundlegend für viele Omik-Analysen. Lange Reads verbessern die Assemblierungsmetriken erheblich, indem sie sich wiederholende Sequenzen überbrücken, Lücken reduzieren und strukturelle Komplexität auflösen. In diesem Abschnitt erkläre ich die mechanistischen Grundlagen, bioinformatischen Strategien und realen Erfolge, die durch die Assemblierung mit langen Reads ermöglicht werden.

7.1 Die zentrale Herausforderung: Wiederholungen, strukturelle Komplexität und Mehrdeutigkeit bei der Kurzleseassemblierung

Kurze Reads (100–300 bp) können oft repetitive Regionen, segmentale Duplikationen und GC-reiche Abschnitte nicht auflösen. Assemblierer müssen Contigs an mehrdeutigen Überlappungen fragmentieren, Wiederholungen zusammenfassen oder ähnliche Sequenzen falsch zusammenfügen. Im Gegensatz dazu können lange Reads (≥10 kb) diese Wiederholungen vollständig überbrücken, den einzigartigen flankierenden Kontext wiederherstellen und eindeutige Contig-Verbindungen ermöglichen.

Komplexe Genome – wie die von Pflanzen, Pilzen, großen Wirbeltieren oder Polyploiden – verschärfen dieses Problem, da sie reich an Wiederholungen und homologen Segmenten sind. Die Unfähigkeit von kurzen Reads, solche Regionen zu unterscheiden, führt oft zu stark fragmentierten Assemblierungen. Der Aufstieg der Langzeit-Sequenzierung hat geholfen, diese Einschränkungen zu überwinden.

7.2 Mechanismen, durch die lange Reads die Kontinuität der Assemblierung erhöhen

Im Folgenden sind die Hauptwege aufgeführt, wie lange Reads die Assemblierung verbessern:

Überbrückung von sich wiederholenden und strukturell komplexen Regionen

Lange Reads umfassen routinemäßig Wiederholungen, Inversionen oder Tandemanordnungen und bieten einen ununterbrochenen Megabase-Kontext, der einzigartige flankierende Sequenzen verbindet.

Die Telomere-zu-Telomere (T2T) menschliche Assemblierung verwendete ultralange Nanopore-Lesungen in Kombination mit HiFi-Lesungen, um Zentromere, rDNA-Arrays und andere zuvor schwer zugängliche Loci vollständig aufzulösen.

Reduzierung von Gerüstlücken und Fehlverbindungen

Wenn Contigs mit Langlese-Nachweisen (oder Scaffolding-Tools, die Langlese verwenden) verbunden werden können, bleiben weniger ungelöste Lücken. Fehlverbindungen, die oft entstehen, wenn Wiederholungsränder falsch orientiert sind, nehmen ab, da die langen Spannweiten die Mehrdeutigkeit verringern.

Auflösung der Heterozygotie und Unterscheidung von Allelen

In diploiden oder polyploiden Genomen können heterozygote Varianten die Assemblierer irreführen. Lange Reads helfen, Haplotypen zu unterscheiden, indem sie die Phasierungsinformationen über lange Blöcke hinweg bewahren und so die Zusammenführung divergenter Allele reduzieren. Das T2T-CHM13-Projekt, obwohl es sich um eine haploide Linie handelt, veranschaulicht die Kraft langer Reads bei der Erreichung eines wirklich lückenlosen Referenzgenoms.

Verbesserte Basisgenauigkeit durch Polierung und Konsens

Nach dem anfänglichen Contig-Bau werden lange Reads zurück zur Assemblierung ausgerichtet und durch iterative Politur korrigieren sie verbleibende Basisfehler oder falsche Indel-Zuordnungen. Algorithmen wie Apollo (universeller Polierer) können Reads aus mehreren Technologien kombinieren, um Assemblierungen zu verfeinern.

Gerüstbau unter Verwendung von langlesebasierten Verknüpfungsnachweisen

Einige lange Reads können Contigs ohne vollständige Überlappung der Assemblierung überbrücken. Werkzeuge wie ntLink Verwenden Sie Long-Read-Scaffolding, um Contigs zu ordnen/orientieren, Lücken zu füllen und Fehlassemblierungen zu erkennen.

7.3 Beste Praktiken und Kompromisse bei der Langzeitassemblierung

Während lange Texte große Vorteile bieten, ist eine durchdachte Strategie unerlässlich:

Die Wahl des Assemblers ist wichtig.

Vergleichende Benchmarks (z. B. "Bewertung von Long-Read-De-Novo-Assemblierungstools für eukaryotische Genome") zeigen, dass kein einzelner Assemblierer in allen Metriken dominiert. Die Wahl hängt von der Genomgröße, der Heterozygotie und der angestrebten Kontiguität ab.

Abdeckungs- und Leselängen-Schwellenwerte

Assemblierungen profitieren von ~20–30× "HiFi-äquivalentem" Long-Read-Coverage mit einer Verteilung, die lange Reads (15+ kb) begünstigt. Ultra-lange Reads (>100 kb) helfen zusätzlich in besonders hartnäckigen Regionen.

Hybridpolitur und mehrstufige Verfeinerung

Selbst "hochgenaue" Langlese-Assemblierungen können verbleibende Indel- oder Fehlanpassungsfehler enthalten. Mehrfaches Polieren (Langlese-Selbstpolieren, gefolgt von Kurzlese- oder Hybridpolieren) reduziert die Fehlerquoten. Polierstrategien sollten plattformspezifische Verzerrungen berücksichtigen.

Kontrolle von Chimären und Fehlassemblierungen

Spurious chimäre Reads oder Fehlverbindungen können die Integrität von Contigs beeinträchtigen. Die Validierung durch orthogonale Daten (optische Karten, Hi-C, verknüpfte Reads) hilft, strukturelle Fehler zu identifizieren und zu korrigieren.

Rechenressourcen und Algorithmuskomplexität

Große Genome und hohe Abdeckungen erfordern erheblichen Speicher und CPU. Einige Assemblierer optimieren die Speichernutzung oder unterteilen das Problem. Testen Sie immer kleine Teilmengen, um den Ressourcenbedarf zu benchmarken.

7.4 Meilensteinleistungen: lückenlose und nahezu vollständige Montagen

T2T-CHM13 menschliche Assemblierung

Das Telomere-to-Telomere-Projekt lieferte ein vollständig lückenloses menschliches Genom und löste zentromerische, rDNA-, Satelliten- und segmentale Duplikationsregionen, die in früheren Referenzen nicht erfasst werden konnten.

Diese Assemblierung offenbarte neuartige genetische Inhalte, korrigierte Fehlassemblierungen und verbesserte die Variantenbestimmung in repetitiven Loci.

Versammlungen von zuvor herausfordernden Arten

Eine aktuelle Studie verwendete modifizierte HiFi-Protokolle an in Ethanol konservierten Museumsproben, um das 3,1 Gb Genom des Mähnenfaultiers mit hoher Kontinuität zusammenzustellen und dabei die bisherigen Einschränkungen hinsichtlich des Proben Typs zu überwinden.

Solche Ergebnisse zeigen, dass selbst "schwierige" Eingabematerialien hervorragende Long-Read-Assemblierungen liefern können, wenn Protokolle und Abdeckung optimiert werden.

Nahe T2T-Assemblierungen mit Nanopore-Ultra-Lang

Laufende Arbeiten erzielen lückenlose (oder nahezu lückenlose) Assemblierungen mit ausschließlich Nanoporen-Daten, insbesondere wenn sie durch Scaffolding-Methoden oder Nähe-Ligation ergänzt werden.Pore-C, Hi-C).

Diese Erfolgsgeschichten bestätigen, dass die Langzeit-Sequenzierung so weit gereift ist, dass Referenz-Qualitätsassemblierungen für nicht-klinische Forschungsprojekte machbar sind.

Fazit

Die Langzeit-Sequenzierung hat sich zu einem unverzichtbaren Werkzeug zur Analyse komplexer Genome entwickelt. Ihre Fähigkeit, sich über sich wiederholende Regionen zu erstrecken, strukturelle Varianten präzise zu erfassen, Allele über große Distanzen zu phasieren und vollständige Transkripte offenzulegen, verwandelt das, was einst als "dunkle Materie" in der Genombiologie galt, in zugängliche Erkenntnisse. In Projekten, in denen strukturelle Variation, allele-spezifische Regulation oder de novo Assemblierung im Mittelpunkt stehen, können Langlese-Sequenzen Entdeckungen ermöglichen, die mit Kurzlese-Sequenzen einfach nicht gemacht werden können.

Das gesagt, hängt eine erfolgreiche Umsetzung von durchdachtem Design ab: die Anpassung von Abdeckung, Leselänge, Fehlerkorrekturen, Alignern und SV-/Phasierungs-Pipelines an Ihre biologischen Fragestellungen. Die oben genannten Fallstudien – von Krebsgenomen bis hin zu polyploiden Pflanzen – zeigen, dass sich die Investition in Klarheit der Interpretation, höhere Variantenausbeute und echte mechanistische Einsichten auszahlt.

Wenn Ihr Team sich auf eine komplexe Genom-Analyse, ein Transkriptom-Projekt oder die Erforschung struktureller Varianten vorbereitet, würden wir uns freuen, mit Ihnen zusammenzuarbeiten. Bei CD GenomicsUnsere Long-Read-Sequenzierungsdienste decken jeden Schritt ab: experimentelles Design, Proben-QC, Bibliotheksvorbereitung, Sequenzierung (PacBio HiFi oder Oxford Nanopore) und maßgeschneiderte bioinformatische Pipelines (strukturelle Variantenbestimmung, Phasierung, Isoformdetektion).

Nächste Schritte, die Sie jetzt unternehmen können:

• Kontaktieren Sie uns um Ihren Probentyp, die genomische Komplexität und die Projektziele zu besprechen
• Fordern Sie ein Angebot an, das auf Ihre Abdeckung, Leselänge und Durchsatzbedürfnisse zugeschnitten ist.
• Überprüfen Sie unser Long-Read-Sequenzierungsdienst Details und Datenlieferungen.

Lassen Sie uns von Mehrdeutigkeit zu Klarheit übergehen – bringen Sie uns Ihr schwierigstes Genomproblem, und wir helfen Ihnen, eine Long-Read-Strategie zu entwickeln, die umsetzbare Erkenntnisse liefert.

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