Wie man die Ergebnisse der DNA-Methylierungssequenzierung validiert

Nach Abschluss der DNA-Methylierungssequenzierung Im Workflow nimmt das nachgelagerte experimentelle Design eine entscheidende Rolle für die weitere Validierung spezifischer Merkmale von Interesse innerhalb der Analyseergebnisse ein. Die anschließende Validierungsphase der DNA-Methylierungsforschung umfasst eine Vielzahl experimenteller Ansätze. Dazu gehören grundlegende und einfache Validierungsverfahren sowie komplexere Experimente zur Störung der gesamten Genom-Methylierung (untargeted). Darüber hinaus erstreckt sie sich auf gezielte Methylierungs-/Demethylierungsassays, die auf spezifische Gene abzielen, um die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Studienergebnisse sicherzustellen.

Validierung von DNA-Methylierungs-Sequenzierungsergebnissen durch einfache Methoden

Einfache Validierung umfasst hauptsächlich die Bestätigung des DNA-Methylierungsstatus und der Genexpressionsniveaus von Zielgenen, wobei die folgenden Methoden einbezogen werden:

Verifizierung der DNA-Methylierung des Zielgens: Zielgerichtete Bisulfit-Sequenzierung (Target-BS)

Gezielte Bisulfit-Sequenzierung (Target-BS) steht als ein robustes Werkzeug für die hochpräzise Validierung des DNA-Methylierungsstatus spezifischer Genregionen. Hierin liegen seine Hauptmerkmale und Anwendungen:

Prinzip der MethodeZielgerichtete Bisulfid-Sequenzierung nutzt die Bisulfidbehandlung, um unmethylierte Cytosine (C) in Uracile (U) umzuwandeln, während methylierte Cytosine (5mC) unverändert bleiben. Durch Hochdurchsatz-Sequenzierung wird die Unterscheidung zwischen methylierten und unmethylierten Cytosinen erreicht.

Ultra-Hochdurchsatz-SequenzierungDie Sequenzierungstiefe der Zielregionen kann mehrere Hundert bis Tausende von Malen Abdeckung erreichen, was Sensitivität und Genauigkeit bei der Detektion gewährleistet. Zum Beispiel nutzten Bibikova et al. (2011) Gezielte Bisulfid-Sequenzierung um Methylierungsmuster bei Brustkrebs zu untersuchen und die Wirksamkeit bei der Erkennung tumorassoziierter Methylierungsveränderungen zu demonstrieren.

Regionenauswahl und Primerdesign: Es müssen spezifische Genregionen von weniger als 300 Basenpaaren ausgewählt werden, und Primer, die spezifisch für die Bisulfitbehandlung sind, werden für Prä-Amplifikationsexperimente entworfen. Zum Beispiel haben Gu et al. (2011) erfolgreich spezifische Primer entworfen und validiert, die auf mehrere kritische Genregionen abzielen, während sie die methylierungsmuster im Genom von Säugetieren untersuchten.

Gezielte Bisulfite-Sequenzierung. Illustriert sind die Schritte, die an der Vorbereitung von biotinylierten RNA-Fangsonden (oben links und rechts), der Eingangsbibliothek für das gesamte Genom (oben Mitte) und der hybridselektionangereicherten Ausgabebibliothek (Mitte links und rechts) beteiligt sind. Die gefangene DNA wurde mit Natriumbisulfid behandelt, durch PCR amplifiziert und mit einem Illumina GAIIx-Sequenzer sequenziert. (Eun-Joon Lee et al., 2011)

Erkennung der mRNA-Expressionsniveaus von Zielgenen: RT-qPCR

Reverse-Transkriptions-Quantitative PCR (RT-qPCR) ist eine hochsensitive Technik, die zur quantitativen Messung der mRNA-Expressionsniveaus eingesetzt wird und präzise Daten liefert, indem sie die Veränderungen der Genexpression quantitativ analysiert.

Methodik: mRNA wird zunächst in cDNA umgeschrieben, gefolgt von Amplifikation und Detektion durch quantitative PCR. Während des Amplifikationsprozesses werden Fluoreszenzfarbstoffe oder Sonden eingesetzt, um die Echtzeit-PCR-Amplifikationskurve zu überwachen. Im Bereich der DNA-Methylierungsforschung verwendeten Yang et al. (2014) RT-qPCR, um die transkriptionalen Veränderungen spezifisch methylierten Gene zu analysieren und damit die Auswirkungen der Methylierung auf die Genexpression zu validieren.

Dateninterpretation: Die relativen Expressionsniveaus der Zielgene unter verschiedenen Behandlungsbedingungen werden basierend auf der Fluoreszenzsignalintensität berechnet. Häufig verwendete Referenzgene (z. B. GAPDH oder ACTB) werden zur Datenstandardisierung eingesetzt.

Protein-Immunoblot-Analyse (Western Blot)

Western Blotting ist eine klassische Technik, die zur Detektion der Proteinexpressionsniveaus von Zielgenen eingesetzt wird, um die Anwesenheit und relative Häufigkeit von Proteinen durch Protein-Elektrophorese-Trennung und spezifische Antikörpererkennung zu validieren.

Methodik: Nach der SDS-PAGE-Proteintrennung werden Zielproteine auf PVDF- oder Nitrocellulosemembranen übertragen. Spezifische Antikörper werden dann zur Erkennung eingesetzt, und die Signaldetektion erfolgt durch Chemilumineszenz oder Fluoreszenz. Towbin et al. (1979) schlugen erstmals die Western-Blotting-Technik vor und stellten der Proteinforschung ein robustes Werkzeug zur Verfügung.

Dateninterpretation: Die relativen Proteinexpressionsniveaus der Zielproteine werden basierend auf dem Verhältnis von Zielproteinen zu internen Referenzproteinen (wie β-Aktin oder GAPDH) berechnet. Zum Beispiel detektierten Jones et al. (2011) die Proteinexpressionsniveaus des methylierungsassoziierten Gens MGMT, das an der Tumorentstehung beteiligt ist, mittels Western Blotting und erläuterten die regulatorischen Mechanismen der Methylierung auf die Proteinexpression. Darüber hinaus untersuchten Nguyen et al. (2010) den Einfluss von DNA-Methylierungsinhibitoren auf die ERα-Proteinexpression in Brustkrebszellen und verwendeten Western Blotting, um die Wirksamkeit der Methylierungsinhibitoren zu validieren.

Diese einfachen Validierungsmethoden bieten grundlegende Datenunterstützung für die Forschung zur DNA-Methylierung und helfen, die spezifische Rolle der Genmethylierung bei der Regulierung der Genexpression und den Krankheitsmechanismen zu verstehen.

Genomweite untargetierte DNA-Methylierungsinterferenzexperimente

Genomweite untargetierte DNA-Methylierungsinterferenzeexperimente stellen eine grundlegende Methode dar, um die Auswirkungen der DNA-Methylierung auf die Genexpression und die Zellfunktion zu untersuchen. Diese Experimente beinhalten eine umfassende Beeinträchtigung des DNA-Methylierungsstatus, um die Rolle der Methylierung im gesamten Genom zu erforschen.

DNA-Methylierungsinterferenz

Knockdown/Knockout/Überexpression von DNA-Methyltransferasen

Durch den Einsatz von Techniken der Gentechnik wie RNA-Interferenz (RNAi), dem CRISPR-Cas9-System oder Überexpressionsvektoren wird die Expression oder Funktion von DNA-Methyltransferasen (z. B. DNMT1, DNMT3A, DNMT3B) gestört, was den gesamten Methylierungsstatus von Zellen verändert. Beispielsweise beobachteten Jones et al. (2012) eine signifikante Reduktion der genomweiten Methylierungslevel und anschließende Veränderungen der Genexpression in embryonalen Stammzellen von Mäusen durch das Ausschalten des DNMT1-Gens. Darüber hinaus erläuterten Okano et al. (1999) die entscheidenden Rollen dieser Methyltransferasen in der frühen Mäuseentwicklung und der genomischen Prägung durch das Ausschalten der Gene DNMT3A und DNMT3B.

DNA-Methylierungsinhibitoren

Chemische Agenzien wie 5-Azacytidin (5-Aza) wirken, indem sie kovalente Bindungen mit DNA-Methyltransferasen eingehen, wodurch deren enzymatische Aktivität gehemmt und die zellulären DNA-Methylierungsniveaus reduziert werden. Christman et al. (2002) untersuchten die Auswirkungen von 5-Aza auf die DNA-Methylierung und die Genexpression in Krebszellen und zeigten dessen signifikante Fähigkeit, die genomweite Methylierung zu verringern und Tumorsuppressorgene zu aktivieren. In einer Studie zu Brustkrebszellen behandelten Glover et al. (1987) die Zellen mit 5-Aza, was zur Hochregulierung mehrerer Gene führte und die entscheidende Rolle der DNA-Methylierung bei der Genstilllegung unterstrich.

Erkennung globaler DNA-Methylierungsänderungen

5mC Methylierung Immunfluoreszenzfärbung (qualitativ)

Die Immunfluoreszenzfärbung mit anti-5mC-Antikörpern ermöglicht die Visualisierung der Verteilung und Veränderungen der DNA-Methylierung innerhalb von Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop. Wu et al. (2010) verwendeten Techniken der 5mC-Immunfluoreszenzfärbung, um den Methylierungsstatus in verschiedenen Zelltypen zu untersuchen, und zeigten die dynamischen Veränderungen der Methylierung während der zellulären Differenzierung auf.

DNA-Spot-Hybridisierung (qualitativ)

DNA-Proben werden auf eine Membran aufgebracht, und die gesamten DNA-Methylierungsniveaus werden durch die Hybridisierung von Proben nachgewiesen. Diese Methode bietet eine schnelle und einfache Möglichkeit, die globale Methylierung zu bewerten.

Färbemetrische Analyse (Quantitativ)

Die Quantifizierung des 5mC-Gehalts in Zell- oder Gewebeproben erfolgt durch enzymgebundene Immunadsorptionstests (ELISA) oder andere kolorimetrische Nachweismethoden. Mohn et al. (2008) verwendeten ELISA, um die DNA-Methylierungsniveaus in embryonalen Stammzellen von Mäusen quantitativ zu bewerten und präzise Methylierungsquantifizierungsdaten bereitzustellen.

Massenspektrometrie (Quantitativ)

Die quantitative Analyse der Methylierungslevels in DNA-Proben erfolgt durch die Technologie der Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS). Liu et al. (2007) verwendeten LC-MS, um den Methylierungsstatus von DNA in Krebszellen zu analysieren und identifizierten Methylierungsbiomarker, die mit dem Tumorfortschritt assoziiert sind.

Erkennung von DNA-Methylierungsänderungen in Zielgenen: Target-BS

Ziel-BS wird eingesetzt, um Veränderungen im Methylierungsstatus spezifischer Gene zu bewerten und die spezifischen Effekte von genomweiten Interferenzeexperimenten zu validieren. Diese Methode liefert durch präzises regionsspezifisches Sequenzieren hochauflösende Methylierungsdaten.

Nachweis der mRNA-Expressionsniveaus von Zielgenen: RT-qPCR

RT-qPCR wird verwendet, um die mRNA-Expressionsniveaus spezifischer Gene nach Methylierungsinterferenzexperimenten zu analysieren und den Einfluss der Methylierung auf die Genexpression zu verdeutlichen. Diese Technik, die Reverse Transkription und quantitative PCR einsetzt, bietet hochsensible Expressionsdaten.

Nachweis der Proteinexpressionsniveaus von Zielgenen: Western Blotting

Western Blotting wird eingesetzt, um die Proteinexpressionsniveaus spezifischer Gene nach Methylierungsinterferenzexperimenten zu bestimmen und die regulatorische Rolle der Methylierung auf die Proteinexpression zu validieren. Durch Proteintrennung, -übertragung und spezifische Antikörperdetektion liefert diese Methode präzise Informationen zur Proteinexpression.

Durch diese Methoden können Forscher die funktionale Rolle der DNA-Methylierung in der Genomregulation umfassend verstehen und somit essentielle Daten zur Unterstützung der Erforschung von Krankheitsmechanismen und therapeutischen Zielen bereitstellen.

Validierung von gezielten Gen-Methylierungs-/Demethylierungs-Experimenten

Die Validierung gezielter Experimente zur Methylierung/Demethylierung von Genen zielt darauf ab, umfassend zu untersuchen, welchen Einfluss der Methylierungsstatus in spezifischen Genregionen auf die Genexpression und deren biologische Funktionen hat. Diese Experimente beinhalten typischerweise präzise Techniken zur Genbearbeitung und zur Analyse der Genexpression, um die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse sicherzustellen.

Beeinträchtigung der DNA-Methylierung des Zielgens

Luciferase-Aktivitätsassay

Dieser experimentelle Ansatz besteht darin, die Methylierung von Plasmiden in vitro durch die Nutzung von CpG-Methyltransferasen durchzuführen, um Zielgen-Luciferase-Expressionsplasmide zu erstellen, die sowohl methylierten als auch unmethylierten Promotoren enthalten. Nach der Einspeisung in die Zellen ermöglichen diese Plasmide die Untersuchung der Auswirkungen, die die Methylierung des Promotors des Zielgens auf die Genexpression hat. Dies geschieht durch die Quantifizierung der Luciferase-Aktivität. Um dies zu veranschaulichen, führten Tiwari et al. (2008) in einer wegweisenden Studie Luciferase-Reporter-Gen-Assays durch und lieferten überzeugende Beweise dafür, dass die Methylierung der Promotorregion des RUNX3-Gens dessen Expression erheblich verringert.

CRISPR-Cas9 gezielte Bearbeitung von DNA-Methylierungsexperimenten

Das CRISPR-Cas9-System ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur genetischen Bearbeitung, das in der Lage ist, Methylierungsmodifikationen an spezifischen DNA-Sequenzen einzuführen oder zu entfernen, indem dCas9 (deaktiviertes Cas9) mit Methyltransferasen (wie DNMT3A) oder Demethylasen (wie TET1) kombiniert wird. Diese Technologie findet umfangreiche Anwendung in der gezielten Forschung zu gen-spezifischer Methylierung/Demethylierung. Beispielsweise haben Liu et al. (2016) erfolgreich die Methylierung in der Promotorregion des p16INK4a-Gens in menschlichen Zellen unter Verwendung des CRISPR-dCas9-DNMT3A-Systems gezielt, was zu einer signifikanten Reduktion seiner Expression führte.

Erkennung von DNA-Methylierungsänderungen in Zielgenen

Ziel-BS

Diese Methode identifiziert nicht nur Methylierungsstellen, sondern analysiert auch quantitativ den Grad der Methylierung. Zum Beispiel nutzen Kulis et al. (2012) Ziel-BS Technologie, führte eine detaillierte Analyse der Methylierungsmuster in kritischen Genregionen bei Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie durch.

Gegenüberstellung von Whole-Genome Bisulfite-Sequenzierung (WGBS) und TBS: Eine epigenetische Analyse-Perspektive

Im Bereich der epigenetischen Analyse der Vergleich zwischen Whole-Genome-Bisulfid-Sequenzierung (WGBS) und TBS findet Resonanz mit der Unterscheidung zwischen RNA-Seq und RT-qPCR in Genexpressionsstudien. Hier ist eine detaillierte Erkundung dieser Analogie:

Umfassende genomweite Abdeckung vs. gezielte Präzision

Ähnlich wie RNA-Seq bietet einen umfassenden Überblick über die Genexpression im gesamten Transkriptom, WGBS bietet eine umfassende Bewertung der DNA-Methylierungsmuster im gesamten Genom. Im Gegensatz dazu bietet TBS, ähnlich wie RT-qPCR, gezielte Präzision, indem es sich auf spezifische genomische Regionen von Interesse konzentriert und es Forschern ermöglicht, tief in die Methylierungsdynamik ausgewählter Loci einzutauchen.

Abdeckungsgrad: Hochauflösung vs. Ultra-Hochpräzision

WGBS, ähnlich wie RNA-SeqDie hochauflösende Profilierung erzeugt umfangreiche Daten durch die Sequenzierung von DNA-Fragmenten aus bisulfitbehandeltem genomischen DNA über das gesamte Genom. Dieser Ansatz liefert wertvolle Einblicke in Methylierungsmuster auf verschiedenen genomischen Ebenen. Im Gegensatz dazu erreicht TBS, ähnlich der ultra-hohen Präzision von RT-qPCR, eine bemerkenswerte Sequenzierungstiefe, die oft mehrere hundert bis tausendfachen Abdeckung erreicht. Diese Tiefe gewährleistet eine robuste und zuverlässige Methylierungsprofilierung mit einer Auflösung auf Einzelbasenebene innerhalb der angestrebten Regionen.

Skalierbarkeit und Flexibilität

Während WGBS Skalierbarkeit und Flexibilität bietet, indem das gesamte Genom untersucht wird, ermöglicht TBS Flexibilität im experimentellen Design, sodass Forscher ihre Analysen auf spezifische genomische Regionen von Interesse zuschneiden können. Dieser gezielte Ansatz reduziert die Sequenzierungskosten und den Rechenaufwand, was ihn zu einer effizienten Strategie für das Studium der Methylierungsdynamik in definierten genomischen Loci macht.

Anpassung und Experimentelles Design

In beiden RNA-Seq Und RT-qPCR sind experimentelles Design und Primerauswahl entscheidend, um genaue und aussagekräftige Ergebnisse zu erzielen. Ebenso erfordert TBS eine sorgfältige Primergestaltung für die Bisulfit-Konversion und die anschließende Amplifikation der Zielregionen. Diese Anpassung gewährleistet die Spezifität und Sensitivität, die notwendig sind, um den DNA-Methylierungsstatus in den gewünschten genomischen Loci genau zu bewerten.

Durch das Ziehen von Parallelen zwischen WGBS und RNA-SeqDurch TBS und RT-qPCR können Forscher ein nuanciertes Verständnis der Stärken und Anwendungen dieser epigenetischen Analysetechniken gewinnen. Ob sie genomweite Methylierungsmuster untersuchen oder spezifische regulatorische Regionen erforschen, die Wahl zwischen WGBS und TBS hängt von den Forschungszielen, den verfügbaren Ressourcen und dem gewünschten Präzisionsgrad ab.

Erkennung der mRNA-Expressionsniveaus von Zielgenen: Echtzeit-Quantitative PCR (RT-qPCR)

Huang et al. (2011) verwendeten RT-qPCR, um die Veränderungen der mRNA-Expressionsniveaus des BRCA1-Gens in Brustkrebszellen nach der Behandlung mit demethylierenden Agenzien zu bewerten. Ihre Studie zeigte die Wiederherstellung der Genexpression nach der Demethylierungsbehandlung.

Nachweis der Proteinexpressionsniveaus von Zielgenen: Western Blotting

Esteller et al. (2000) verwendeten die Western-Blot-Analyse, um die Proteinexpressionsniveaus des hMLH1-Gens in kolorektalen Krebszellen nach der Behandlung mit demethylierenden Agenzien zu messen. Die Studie bestätigte die Wiederherstellung der Proteinexpression nach der Demethylierungsbehandlung.

Bewertung der funktionalen Auswirkungen auf Zellen

Immunfluoreszenz-Mikroskopie-Beobachtung

Durch Immunfluoreszenzfärbung und mikroskopische Beobachtung analysierten die Forscher die Auswirkungen von Veränderungen der Zielgenexpression auf die Zellmorphologie und -funktion.

Funktionale Biomarker-Assays

Durch die Erkennung von Biomarkern, die mit dem Zellzyklus, der Proliferation, Apoptose und anderen Funktionen in Verbindung stehen, wird der Einfluss von Veränderungen im Methylierungsstatus von Zielgenen auf die Zellfunktion bewertet. Zum Beispiel untersuchten Good et al. (2017) die Rolle von TET2 bei akuter myeloischer Leukämie (AML) und zeigten dessen entscheidende Beteiligung an Zellproliferation und Apoptose durch funktionale Biomarkeranalysen. Ihre Forschung ergab, dass TET2-Mutationen, indem sie die DNA-Demethylierungsniveaus beeinflussen, zu abnormer Proliferation und anti-apoptotischen Eigenschaften in AML-Zellen führen. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung von TET2 bei der Regulierung der Zellfunktion und betonen die DNA-Methylierung als potenzielles therapeutisches Ziel bei Krebs.

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