Metagenomische Sequenzierungsdaten: Schritt-für-Schritt-Anleitung von der Qualitätsprüfung bis zu Erkenntnissen

Einführung

Metagenomische Sequenzierung Datenanalyse enthüllt verborgene Geschichten über komplexe mikrobielle Ökosysteme. Durch die Befolgung eines klaren Metagenomanalyse-Workflows können Forscher rohe Sequenzen in umsetzbares Wissen umwandeln – neue Arten entdecken, Gene für Antibiotikaresistenz verfolgen und Stoffwechselnetzwerke kartieren. Dieser Leitfaden führt Sie durch jeden wesentlichen Kontrollpunkt:

• Datenintegritätsprüfungen zur Bestätigung der Dateivollständigkeit
• Qualitätskontrolle und Entfernung von Wirts-DNA für sauberere nachgelagerte Ergebnisse
• Versammlungs- und Binning-Strategien zur Erstellung von Contigs und MAGs
• Genvorhersage, Häufigkeitsberechnung und Annotation für funktionale Einblicke
• Statistische Tests und Visualisierung, die biologische Bedeutung offenbaren

Egal, ob Sie menschliche Darmmikrobiome oder Tiefsee-Sedimente untersuchen, die folgenden schrittweisen Tipps werden Ihre metagenomischen Sequenzierungsdatenanalysen von Anfang bis Ende stärken.

1 Datenintegritätsbewertung

Die vorläufige Validierungsphase umfasst die Überprüfung der Dateigröße, die erfolgreiche Dekompression und das Fehlen von Zeichenkorruption. Anschließend wird eine kryptografische Hash-Funktion mit md5sum angewendet, um die Byte-für-Byte-Integrität der Sequenzarchive zu bestätigen.

2 Datenvorverarbeitung

Metagenomische Pipelines verlaufen typischerweise über zwei Hauptpfade. Der erste setzt kurze Reads zu Contigs zusammen, um nachgelagerte Genvorhersagen und funktionale Untersuchungen durchzuführen. Der zweite konstruiert metagenomisch assemblierte Genome (MAGs) durch Binning, gefolgt von taxonomischer Profilierung und differenzieller Analyse funktioneller Gene (Abbildung 1).

Abbildung 1. Kurzer Prozess der metagenomischen Analyse.

2.1 Qualitätskontrolle

Rohe Illumina-Daten (FASTQ) enthalten häufig Adaptersequenzen und niedrigqualitative Basen. Die Qualitätsvisualisierung der Reads erfolgt mit FastQC (Andrews 2010), während Trimmomatic, das in KneadData integriert ist, Adapter entfernt und substandard Nucleotide trimmt (Bolger et al. 2014). Vor der Verarbeitung werden die gepaarten Dateien mit den Suffixen "_1" und "_2" umbenannt, um die Softwarekompatibilität sicherzustellen. MultiQC aggregiert Qualitätsmetriken über mehrere Proben hinweg in einem einheitlichen Bericht (Ewels et al. 2016). Bibliotheken werden allgemein akzeptiert, wenn ≥85 % der Basen Phred-Werte ≥30 (Q30) aufweisen und der GC-Gehalt im erwarteten Bereich liegt.

2.2 Entfernung der Wirtssequenz

Proben aus wirtassoziierten Umgebungen enthalten häufig Wirt-DNA, die das mikrobielle Signal verringert. Referenzgenome, die von Ensembl Genomes stammen, werden indiziert, und die Reads werden mit Bowtie2, BWA, KneadData oder Kraken2 ausgerichtet, um Wirtssequenzen zu entfernen (Langmead et al. 2009; Li und Durbin 2009; Wood et al. 2019). Benchmarking zeigt, dass Kraken2 eine überlegene Verarbeitungsgeschwindigkeit und einen reduzierten Ressourcenverbrauch bietet (Gao et al. 2025) (Abbildung 2). Eine sekundäre FastQC-Bewertung bestätigt die Verbesserung. In einer repräsentativen Studie beseitigte die Ausrichtung mit Bowtie2 an das menschliche Referenzgenom (GRCh38) 98 % der Wirt-Reads, was die Nachweisempfindlichkeit für Clostridioides difficile von 50 % auf 90 % erhöhte und die Profilierung von Antibiotikaresistenzgenen erheblich verbesserte (Kok et al. 2022).

Abbildung 2. Speicherverbrauch (obere rechte Diagonale) und Ausführungszeit (untere linke Diagonale) zwischen verschiedenen Softwareanwendungen (Gao et al. 2025).

3 Sequenzassemblierung und Binning

3.1 De novo-Assembly

Kurzlesebibliotheken werden mit MEGAHIT (Li et al., 2015) oder metaSPAdes (Bankevich et al., 2012) in zusammenhängende Sequenzen (Contigs) umgewandelt. Die K-mer-Länge, typischerweise eine ungerade ganze Zahl, hat einen entscheidenden Einfluss auf die Effizienz und Genauigkeit der Assemblierung; optimale Werte können mit KmerGenie (Chikhi und Medvedev, 2014) abgeleitet werden. metaSPAdes produziert Contigs mit überlegener Treue, allerdings zu höheren Rechenkosten, was es für Projekte mit einzelnen Proben geeignet macht, während MEGAHIT eine schnelle Co-Assemblierung über mehrere Proben ermöglicht. Für einen 252 Gb großen Bodendatensatz schloss die GPU-beschleunigte MEGAHIT-Assemblierung innerhalb von 44,1 Stunden ab, verdreifachte N50 und die durchschnittliche Contig-Länge im Vergleich zu herkömmlichen Methoden und erhöhte die Read-Mapping-Rate auf 55,8 % - eine vierfache Verbesserung (Li et al., 2015). Erhöhte N50-Werte spiegeln eine verbesserte Kontinuität der Assemblierung wider.

3.2 Binning und Genomrekonstruktion

Zusammengesetzte Contigs werden über MetaBAT 2 (Kang et al., 2019) oder verwandte Algorithmen in metagenomisch assemblierte Genome (MAGs) gruppiert. Die Ausgaben von MaxBin 2, MetaBAT 2 und CONCOCT werden routinemäßig mit dem MetaWRAP-Workflow (Uritskiy et al., 2018) integriert. Das Modul zur Bin-Verbesserung setzt Entwürfe von Genomen neu zusammen und berücksichtigt dabei vom Benutzer festgelegte Vollständigkeits- und Kontaminationsschwellen; quant_bins ordnet anschließend die Probenlesungen jedem Bin zu, um die relative Häufigkeit zu quantifizieren. Die Anwendung dieses Protokolls auf die fermentierte Sojabohnenmikrobiota (Sieng) aus Kambodscha ergab sechs hochwertige MAGs (Tamang et al., 2023), während eine separate Untersuchung 126 MAGs in 58 nicht redundante genomische Datensätze dereplizierte (Banchi et al., 2023) (Abbildung 3).

Abbildung 3. Eine Studie stellte 58 nicht-redundante genomische Datensätze aus 126 metagenomischen Assemblierungsgenomen (MAGs) zusammen. (Banchi et al. 2023)

4 Genvorhersage und Redundanzeliminierung

Offene Leserahmen und nicht-kodierende RNAs werden mit Prokka (Parameter --metagenome) annotiert, das Prodigal und Infernal einbettet, um die entsprechenden Proteinsequenzen abzuleiten (Seemann 2014). Die resultierenden Fasta-Dateien können weiter mit SeqKit bearbeitet werden. Signalsequenzen werden mit SignalP 6.0 abgeleitet, während Transmembranhelices und, in der Folge, sekretierte Proteine mit TMHMM erkannt werden.

Um die durch hochgradig ähnliche Sequenzen verursachte Inflation zu mildern, werden die vorhergesagten Proteine mit CD-HIT oder MMseqs2 gruppiert, wodurch ein nicht redundanter Genkatalog (Unigene-Set) erstellt wird, der für quantitative und funktionale Analysen geeignet ist (Fu et al. 2012; Steinegger und Söding 2017). Die Ähnlichkeitsschwellen werden entsprechend den Projektzielen angepasst. Diese Strategie ermöglichte die Wiedergewinnung und funktionale Annotation von metagenomisch abgeleiteten Genen aus Sedimenten der Lagune von Venedig (Abbildung 4; Studie zur marinen Biowissenschaft und Technologie).

Abbildung 4. Heatmap der in den MAG-Daten (Banchi et al. 2023) detektierten biosynthetischen Gencluster (BGCs).

5 Quantifizierung der Genabundance

Die Gen-Abundanzprofilierung liefert relative oder absolute Schätzungen spezifischer Loci innerhalb mikrobieller Konsortien und schlussfolgert somit die metabolische Kapazität der Gemeinschaft. Zwei weit verbreitete Strategien sind unten zusammengefasst.

Die Gen-Abundanzprofilierung liefert relative oder absolute Schätzungen spezifischer Loci innerhalb mikrobieller Konsortien und schlussfolgert somit die metabolische Kapazität der Gemeinschaft. Zwei weit verbreitete Strategien werden im Folgenden zusammengefasst.

• Read-Mapping-Strategie. Sequenzierungsreads werden mit BWA oder Bowtie 2 an einen nicht-redundanten Genkatalog (Unigenes) ausgerichtet. Die Genabdeckung wird anschließend mit CoverM berechnet und als Transkripte pro Million (TPM), Reads pro Kilobase pro Million (RPKM) oder unnormalisierte Zählungen normalisiert (Mortazavi et al., 2008; Corchete et al., 2020). TPM ermöglicht einen robusten Vergleich zwischen den Proben, während RPKM für Single-End-Bibliotheken weiterhin bevorzugt wird.
• k-mer-basierte Strategie. Die alignierungsfreie Schätzung wird mit Salmon durchgeführt, das die Häufigkeit direkt aus k-mer Frequenzen ableitet und somit den Rechenaufwand reduziert.

6 Taxonomische und Funktionale Annotation

6.1 Taxonomische Profilierung

Die taxonomische Rekonstruktion erhellt die Gemeinschaftszusammensetzung und erleichtert die Entdeckung neuer Taxa. Drei komplementäre Algorithmen werden routinemäßig eingesetzt:

• Kraken 2 klassifiziert Reads durch k-mer Hashing und erreicht eine hohe Sensitivität, insbesondere für Organismen mit niedriger Häufigkeit, obwohl eine erhöhte Falsch-Positiv-Rate berichtet wurde.
• MetaPhlAn 4 nutzt kladespezifische Marker-Gene, um eine Präzision auf Artenebene zu bieten, könnte jedoch Taxa übersehen, die keine kanonischen Marker aufweisen.
• GTDB-Tk identifiziert universelle Marker-Gene, erstellt Multiple-Sequenz-Ausrichtungen und führt phylogenomische Platzierungen durch, wodurch eine verfeinerte Klassifikation zuvor unbeschriebener Linien angeboten wird (Chaumeil et al., 2020; Manghi et al., 2023).

In den Standardarbeitsabläufen liefert MetaPhlAn 4 das grundlegende taxonomische Profil; Kraken 2 ergänzt die Erkennung seltener Arten; und GTDB-Tk klärt mehrdeutige oder neuartige Kladen. Kritische Zuordnungen werden manuell mit BLAST-Suchen verifiziert. Die Gemeinschaftsstruktur und die phylogenetischen Beziehungen für die vorliegende Studie sind in den Abbildungen 5 und 6 dargestellt.

Abbildung 5. Taxonomisches Profil der Ascomycota-Komponente in den Proben basierend auf einem Krona-Diagramm (Tedersoo et al. 2021).

Abbildung 6. Phylogenetischer Baum von MAGs, die aus Sedimenten der Lagune von Venedig rekonstruiert wurden, basierend auf einer concatenated Ausrichtung von 43 konservierten Marker-Genen. (Banchi et al. 2023)

6.2 Funktionale Annotation

Die initiale funktionale Vorhersage von metagenomisch assemblierten Genomen (MAGs) wurde mit Prokka durchgeführt, das Prodigal und Infernal für die Annotation von offenen Leserahmen und RNA integriert. Orthologe Gruppen wurden anschließend mit eggNOG-mapper gegen die eggNOG-Datenbank (Huerta-Cepas et al.) zugewiesen. Zusätzliche domänenspezifische Analysen wurden gemäß den Studienzielen durchgeführt: Rekonstruktion von Stoffwechselwegen mit KofamKOALA; Identifizierung von kohlenhydrataktiven Enzymen über das CAZy-Repository; Klassifizierung von Proteasen mit der MEROPS-Datenbank; Nachweis von Genen für antimikrobielle Resistenzen mithilfe von AMRFinderPlus; und Vorhersage des metabolischen Potenzials der Gemeinschaft mit HUMAnN 3 (Aramaki et al., 2020; Beghini et al., 2021).

Die verkettete Annotationspipeline ermöglichte die Inferenz von Genen des Kohlenstoff-, Stickstoff- und Schwefelkreislaufs sowie von biosynthetischen Genclustern innerhalb der MAGs aus dem Sediment der Lagune von Venedig (Abbildung 7; Banchi et al., 2023).

Abbildung 7. Heatmap, die das metabolische Potenzial der MAGs basierend auf der Anwesenheit von Schlüsselenzymen und Stoffwechselwegen zeigt (Banchi et al. 2023).

7 Datenanalyse und -visualisierung

7.1 Statistische Auswertung der Genhäufigkeit

Eine Gen-Abundanzmatrix, normalisiert als Transkripte pro Million (TPM) oder rohe Lesezahlen, wurde für die Analyse der differentiellen Expression erstellt. Niedrig-abundante Merkmale und Batch-Effekte wurden vor der Inferenz gefiltert. Differentielle Gene wurden mit DESeq2 in R identifiziert, wobei ein adjustierter P-Wert < 0,05 und |log₂ Fold-Change| > 1 angewendet wurden. Eine zusätzliche Merkmalsauswahl verwendete die Effektgröße der linearen Diskriminanzanalyse (LEfSe; LDA-Score > 2) und die Klassifikation mit Random Forest. Wo maschinelle Lernmodelle implementiert wurden, wurden Kandidaten-Biomarker, die eine Fläche unter der Empfangs-Betriebscharakteristik-Kurve (AUC) > 0,70 aufwiesen, als informativ angesehen.

7.2 Ergänzende Analysen und Visualisierung

Netzwerkassoziationsmapping, Differentialgen-Darstellung und Zeitreihenbewertung wurden nach Bedarf durchgeführt. Umweltfaktoren der Gemeinschaftsstruktur wurden mit eingeschränkter Ordination - kanonischer Korrespondenzanalyse (CCA) oder Redundanzanalyse (RDA) - unter Verwendung des vegan-Pakets in R untersucht. Die resultierenden Ordinationen wurden mit ggvegan und ggplot2 dargestellt, um eine angepasste grafische Ausgabe zu ermöglichen (Abbildung 8).

Abbildung 8. Korrelationsanalyse zwischen Umweltfaktoren und der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft (Liu et al. 2023).

Fazit

Metagenomische Studien erfolgreich, wenn jeder Schritt der Pipeline - Qualitätsfilterung, Assemblierung, Binning, Annotation und Statistik - harmonisch zusammenarbeitet. Von:

• Überprüfung der Datenintegrität vor der Analyse,
• Entfernung von Wirtskontamination zur Schärfung mikrobieller Signale,
• Die Auswahl von Montagetools, die zur Datensatzgröße und zu den Zielen passen,
• Verfeinerung von MAGs und nicht redundanten Genkatalogen, und
• Verknüpfung von Taxonomie, Funktion und Umwelt mit rigoroser Statistik,

Forscher erhalten einen panoramischen Überblick über mikrobielle Vielfalt und Funktion. Die Annahme dieser Best-Practice-Kontrollpunkte wird die Genauigkeit erhöhen, die Verarbeitungszeit verkürzen und helfen, Sequenzierungsdaten in ökologische oder klinische Erkenntnisse zu übersetzen. Während sich die Werkzeuge weiterentwickeln, sorgt das regelmäßige Benchmarking neuer Software gegen Ihren bestehenden Workflow dafür, dass Ihre metagenomischen Sequenzierungstipps zukunftssicher und reproduzierbar bleiben.

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