Genomassemblierung: Überblick über die Werkzeuge

Konventionell Genomassemblierung ist eine zentrale rechnergestützte Aufgabe in der Genomik, bei der der Zusammensteller das vollständige Genom aus einer Sammlung von kurzen Zusammenfassungen von DNA- oder RNA-Sequenzen rekonstruiert. Dieser Prozess bildet die Grundlage für viele Bereiche der biologischen Forschung, von Fragen zur Genfunktion über evolutionäre Forschung bis hin zu forensischen Anwendungen. Genomassemblierung ist ein erster Schritt in vielen genomischen Studien, und die Qualität der Assemblierung beeinflusst ihre Verwendung für die Variantenbestimmung und phylogenetische Inferenz. Die Genomassemblierung wird durch spezialisierte Werkzeuge und Algorithmen erleichtert und optimiert, die darauf ausgelegt sind, diese Herausforderungen anzugehen, einschließlich Aspekte wie sich wiederholende Sequenzen, Sequenzierungsfehler und die schiere Menge an Rohdaten, die durch Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien erzeugt werden.

Die Genomassemblierung hat sich zusammen mit entwickelt. Genomsequenzierungstechnologien (Sanger, Illumina, PacBio und Oxford Nanopore) und die damit verbundenen Assemblierungsmethoden. Diese resultierenden Werkzeuge haben die Assemblierung von Genomen ermöglicht, die von kleinen viralen Genomen bis hin zu großen Eukaryotengenomen reichen, die typischerweise hoch repetitiv und polyploid sind. Jedes Werkzeug hat seine eigenen Einschränkungen und Vorteile, was auch für bestimmte Datentypen sowie für die Komplexität der Genome und die Forschungsziele gilt. Dieser Artikel bietet einen Überblick über die wichtigsten Klassen von Genome-Assemblierungstools, was sie tun und wie sie sich in der Genomik-Landschaft entwickelt haben.

Genomische Werkzeuge zur Genomassemblierung

Genomassemblierungswerkzeuge können im Allgemeinen nach der Art der Sequierungsdaten, auf denen sie basieren, und nach der von ihnen verfolgten Assemblierungsstrategie unterteilt werden. In Übereinstimmung damit decken die oben genannten Kategorien ein biologisch relevantes Spektrum von Herausforderungen ab – Genauigkeit, Skalierbarkeit und die Assemblierung komplexerer Genome. Um die im Prozess aufgetretenen Probleme anzugehen, de novo GenomassemblierungImmer mehr Werkzeuge werden entwickelt.

Werkzeuge zur Assemblierung von Kurzlese-Daten

Eine Kurzlese-Sequenzierungsplattform ist Illumina, die Einzelreads mit extrem hoher Genauigkeit erstellt, typischerweise 50 bis 300 Basenpaare lang. Diese Kurzreads sind ideal, um Bereiche tiefgehend abzudecken und kleine Varianten zu finden, aber sie lösen keine langreichweitigen genomischen Strukturen oder sich wiederholende Bereiche auf.

• SPAdesSPAdes ist das am häufigsten verwendete Tool für kleine GenomassemblierungDer auf De-Bruijn-Graphen basierende Ansatz ermöglicht es, Kurzlesedatensätze schnell zu verarbeiten. SPAdes: für mikrobielle Genome, Metagenome und Transkriptom-Assemblierungen. Aufgrund seiner starken Fehlerkorrekturcodes und der Verwendung eines iterativen Assemblierungsprozesses erreicht das Gerät sehr niedrige Fehlerquoten, was es zu einer beliebten Wahl für Anwendungen macht, bei denen Genauigkeit gewünscht ist.
• SamtVelvet war eines der ersten Werkzeuge, das für die Assemblierung von Kurzlesungen entwickelt wurde, und ist nach wie vor eine sehr lesbare Wahl für moderat komplexe Genomprojekte. Der Aufbau von De-Bruijn-Graphen damit ist speichereffizient – die Rechenlänge wird zugunsten der Genauigkeit der Assemblierung geopfert. Velvet glänzt besonders bei Datensätzen mit konstanter Abdeckung.
• SOAPdenovoSOAPdenovo ist für die Genome großer Projekte konzipiert und zeichnet sich bei der Assemblierung von Pflanzen- und Tiergenomen aus kurzen Lesedaten aus. Es nutzt parallele Rechentechniken, um die rechnerischen Anforderungen großer Datensätze zu bewältigen, und ermöglicht es Forschern, Genome mit langen Wiederholungsregionen zusammenzustellen, solange die Sequenzierungstiefe ausreichend ist.

Langzeit-Lesewerkzeuge

Langzeit-Sequenzierung Plattformen (PacBio und Oxford Nanopore) erzeugen Reads in Größenordnungen von Zehntausenden von Basen. Diese Reads eignen sich besonders gut zur Analyse von repetitiven Sequenzen, strukturellen Modifikationen und anderen schwierigen Bereichen von Genomen, die mit Short-Read-Daten nicht angegangen werden können.

• CanuDer Canu-Assembler ist ein ausgezeichneter Assembler für hochfehlerhafte Langlesedaten. Canu verwendet einen Overlap-Layout-Consensus (OLC)-Algorithmus, der Reads ausrichtet, Überlappungen findet und Reads anordnet, um sehr zusammenhängende Assemblierungen zu erstellen. Er eignet sich besonders gut für den Aufbau der Genome großer, komplexer Organismen — sogar von wiederholungsreichen Organismen — und hat die Tür zur Referenzqualität bei der Assemblierung der Genome von Pflanzen und Tieren geöffnet.
• FlyeDieser Assembler ist für Geschwindigkeit optimiert und für die Assemblierung von Genomen aus rauschhaften Langzeitdaten ausgelegt. Seine fehlertoleranten Algorithmen ermöglichen es, mikrobielle und eukaryotische Genome mit hoher Effizienz zu rekonstruieren. Die schnellen Workflows von Flye ermöglichen ein Spektrum von Anwendungen, von der akademischen Forschung bis hin zu industriellen Anwendungen, die eine beschleunigte Bearbeitungszeit erfordern.
• ShastaDiese Technologie ist auf ultra-lange Reads ausgerichtet und ermöglicht die schnelle Verarbeitung großer Genome mit guter rechnerischer Effizienz, die modernste Algorithmen zur Fehlerkorrektur von Reads und zur Erstellung von Assemblierungslayouts umfasst, um sehr zusammenhängende Assemblierungen für großangelegte Projekte wie menschliche Genome zu produzieren.

Hybride Montagewerkzeuge

Hybrid-Methoden-Assemblierungsalgorithmen nutzen die Vorteile sowohl von Kurz- als auch von Langsequenzierungen. Dies ermöglicht es ihnen, eine effektive Lösung zur Assemblierung schwieriger Genome zu entwickeln, indem sie sowohl die Präzision von Kurzlesungen als auch den Umfang von Langlesungen kombinieren.

• MaSuRCASoftware, um eine Assemblierung mit Illumina-Short-Reads und PacBio- oder Nanopore-Long-Reads zu versuchen. Die Algorithmen richten die Reads iterativ aus und fügen sie zusammen, um Kontinuität und Genauigkeit zu fördern und gleichzeitig sich wiederholende Regionen zu lösen. MaSuRCA ist besonders gut für große, sich wiederholende Genome geeignet; Pflanzen- und Amphibien-Genome passen in diese Beschreibung.
• EinradfahrerUnicycler, das für die Assemblierung bakterieller Genome entwickelt wurde, unterstützt sowohl Kurz- als auch Langzeitdaten für vollständige, zirkularisierte Assemblierungen. Es hat sich aufgrund seiner Genauigkeit in Bezug auf Plasmide und kleine Genome zum bevorzugten Werkzeug für die Mikrobiom-Genomik entwickelt.
• SPAdes (Hybrid-Modus)Erweiterungen zu SPAdes umfassen hybride Datensätze, die mehrere Sequenzierungsplattformen integrieren, um die Assemblierungsqualität zu verbessern. Dies ist besonders hilfreich für metagenomische Projekte, die mehrere Sequenzierungstechnologien kombinieren.

Funktionen von Genom-Assemblierungstools

Es gibt eine Vielzahl von Genom-Assemblierungstools, um die Herausforderungen der Sequenzierungsdaten, die im Prozess inherent sind, zu bewältigen. Solche Eigenschaften sind wichtig, um die Vollständigkeit und Genauigkeit der Genomassemblierung zu bewahren.

• FehlerkorrekturSequenzierungsfehler verringern die Qualität der Assemblierung, insbesondere in Datensätzen, die von Plattformen mit hoher Fehlerquote, wie Nanopore, erstellt wurden. Werkzeuge wie Pilon (kurze Reads) und Racon (lange Reads) verfeinern die Assemblierungen weiter, indem sie Abweichungen erkennen und beheben, was die Basisgenauigkeit erheblich verbessert.
• GerüstbauGerüstbau verbindet Contigs zu größeren, geordneten Strukturen unter Verwendung anderer Daten, wie Mate-Paar-Reads oder langen Reads. SPACEs und LINKs nutzen diese räumlichen Informationen, um Gerüste zu erzeugen, die die chromosomale Anordnung der Sequenzen widerspiegeln, wodurch die Kontinuität und Genauigkeit der Assemblierungen erhöht wird.

Skalierbarkeitsergebnisse von Minimap und GraphMap (Senol Cali et al. 2019).

• PolierenPolierwerkzeuge korrigieren verbleibende Fehler in der letzten Montage, um die höchste Genauigkeit in Montagen zu gewährleisten. Zum Beispiel sind Nanopolish und Arrow speziell dafür entwickelt, langlesebasierte Montagen zu polieren, und Pilon ist eines der beliebtesten Werkzeuge zum Polieren von Illumina-basierten Datensätzen.
• WiederholungsauflösungWiederholungen können eines der schwierigsten Merkmale bei der Genomassemblierung sein und stellen insbesondere eine Herausforderung innerhalb eukaryotischer Genome dar. Viele Assemblierer, einschließlich Canu und Flye, enthalten Algorithmen zur Identifizierung und Auflösung repetitiver Regionen, die es ihnen ermöglichen, die vollständige Sequenz sowie die zusammenhängende Sequenz zu rekonstruieren.

Werkzeuge zur Genomassemblierung: Trends und Fortschritte in der Software

Genomassemblierungswerkzeuge entwickeln sich ebenfalls mit den Sequenzierungstechnologien weiter, um neuen Herausforderungen zu begegnen und neue Möglichkeiten zu nutzen. Wichtige Fortschritte umfassen:

• Ultra-lange LeseassemblierungenDa ultra-lange Reads (länger als 1 Mb) zunehmend zugänglich werden, sind Werkzeuge entstanden, die Genome mit einem beispiellosen Maß an Kontinuität zusammenstellen. Diese Werkzeuge ermöglichen es Forschern, zuvor schwer zugängliche Regionen wie Zentromere und Telomere zu entschlüsseln und werfen Licht auf Aspekte der chromosomalen Architektur und Funktion.
• Künstliche Intelligenz und Maschinelles LernenMaschinenlernalgorithmen werden eingesetzt, um die Arbeitsabläufe der Genomassemblierung zu verbessern, mit dem Ziel, die Fehlerkorrektur, die Auflösung von Wiederholungen und die Erkennung struktureller Variationen zu maximieren. Durch die Integration von KI-gesteuerten Werkzeugen werden die Assemblierungsprozesse in Geschwindigkeit und Genauigkeit verbessert, insbesondere in komplexeren Regionen und größeren Genomen. Weitere Einzelheiten finden Sie in unserem Artikel "Genom-Indexierung in der Bioinformatik: Das Genom entschlüsseln".
• Cloud-basierte PipelinesDie Ära des Cloud-Computing bietet skalierbare und kostengünstigere Möglichkeiten zur Datenverarbeitung bei der Genomassemblierung. Diese Plattformen ermöglichen es Forschern, große, komplexe Genome zu erstellen, ohne dass eine signifikante lokale Recheninfrastruktur erforderlich ist.
• End-to-End-AutomatisierungPipelines mit einem integrierten System, das die Automatisierung von Genomassemblierung, Annotation und Visualisierung ermöglicht, gewinnen an Bedeutung. Solche Systeme erleichtern den Arbeitsablauf, minimieren menschliches Eingreifen und verbessern die Reproduzierbarkeit genomischer Analysen.

Genomassemblierungswerkzeuge und ihre Bedeutung in der heutigen Zeit

Genomassemblierungswerkzeuge sind zu unverzichtbaren Instrumenten in der Genomik geworden und ermöglichen Entdeckungen in zahlreichen Bereichen. Sie bilden die Grundlage für Anwendungen in der medizinischen Forschung, Landwirtschaft, Evolutionsbiologie und mehr.

Hintergrund

Einer der größten wissenschaftlichen Erfolge des 20. Jahrhunderts war das Humangenomprojekt (HGP), das darauf abzielte, das vollständige menschliche Genom zu sequenzieren und zusammenzustellen. Es wurde 1990 ins Leben gerufen und basierte auf frühen Technologien und rechnerischen Methoden. Die Zusammenstellung des menschlichen Genoms war ein entscheidender Moment im Bereich der Genomik und bot eine Referenzkarte zur Aufklärung der menschlichen Biologie und Krankheiten.

Methoden

• SequenzierungDie frühen Phasen des Projekts verwendeten die Sanger-Sequenzierung, die hochwertige Reads produziert, jedoch zeitaufwendig und teuer ist. Überlappende BAC (bakterielle künstliche Chromosomen)-Klone wurden nacheinander verwendet, um das Genom in kleinere Abschnitte zu unterteilen.
• MontagestrategienEin hierarchischer Shotgun-Sequenzierungsansatz wurde verwendet. BACs wurden eingesetzt, um große DNA-Fragmente zu klonen, die dann in kleinere Fragmente zerschnitten und sequenziert wurden. Computeralgorithmen richteten diese Fragmente aus und setzten sie zu zusammenhängenden Sequenzen (Contigs) und Gerüsten (Scaffolds) zusammen.
• ValidierungDie Qualität der Assemblierung wurde validiert, indem sie mit bekannten genetischen Markern verglichen und gegen physische Karten des Genoms abgebildet wurde. In den nachfolgenden Phasen wurden Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten integriert, um fehlende Informationen zu ergänzen und Unklarheiten zu beseitigen.

Ergebnisse

Das HGP stellte 2001 einen Entwurf des menschlichen Genoms vor, der mehr als 90 % des Genoms abdeckte und bis auf die Ebene der Basen genau war. 2003 wurde eine nahezu vollständige Version mit etwa 99 % Abdeckung und minimalen Lücken veröffentlicht. Das assemblierte Genom bestand aus 3 Milliarden Basenpaaren mit 20.000–25.000 mutmaßlichen protein-codierenden Genen. Das Humangenomprojekt wird weithin als ein Meilenstein angesehen, der viele Fortschritte ermöglichte, wie die Identifizierung von krankheitsverursachenden Genen, die Entwicklung gezielter Therapien und die Erforschung der menschlichen Evolution.

HGP-Ziele und Erreichungsdaten (Collins, F. S. et al. 2003)

Fazit

Werkzeuge für Genomassemblierung haben das Gebiet der Genomik revolutioniert und es Forschern ermöglicht, hochqualitative Genome mit immer größerer Genauigkeit und Effizienz zu rekonstruieren. Bestimmte Datensätze und Forschungsziele können auch eine effiziente Genomassemblierung fördern oder behindern. Da sich Sequenzierungstechnologien und rechnerische Methoden weiterhin weiterentwickeln, werden diese Werkzeuge eine noch größere Rolle bei der Entwicklung unseres Konzepts des genetischen Bauplans des Lebens spielen.

Referenzen:

1. Senol Cali, D., Kim, J. S., Ghose, S., Alkan, C., & Mutlu, O. (2019). Nanoporen-Sequenzierungstechnologie und Werkzeuge zur Genomassemblierung: Computergestützte Analyse des aktuellen Stands, Engpässe und zukünftige Richtungen. Briefings in Bioinformatik, 20(4), 1542–1559. Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von externen Links übersetzen. Bitte geben Sie den Text ein, den Sie übersetzen möchten.
2. Collins, F. S., Morgan, M. und Patrinos, A. (2003). Das Humangenomprojekt: Lehren aus der großangelegten Biologie. Wissenschaft (New York, N.Y.), 300(5617), 286–290. Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von externen Links oder spezifischen Artikeln übersetzen. Wenn Sie den Text, den Sie übersetzt haben möchten, hier eingeben, helfe ich Ihnen gerne weiter.