Förderung der Tumorheterogenität: Die Auswirkungen von zyklischer extrachromosomaler DNA (ecDNA)

Was ist zirkuläre extrachromosomale DNA (ecDNA)?

Seit den 1960er Jahren wurde die Präsenz von zyklischem extrachromosomalem DNA (ecDNA) in isolierten Tumoren und tumorabgeleiteten Zellen dokumentiert. Charakterisiert als ein zirkulärer, unfilamentöser Chromatin-Körper mit variablen Längen, die von mehreren Dutzend Kilobasen bis zu mehreren Dutzend Megabasenpaaren (Mbp) reichen, zyklische ecDNA emergiert als ein entscheidender Faktor, der zur intra-tumoralen Heterogenität beiträgt. Seine Beteiligung an der Tumorentstehung, der Tumorevolution und der Entwicklung von Arzneimittelresistenz unterstreicht seine Bedeutung.

Zyklische ecDNA & Krebs

Zyklisches ecDNA spielt eine herausragende Rolle als verbreitete Form der Hochkopie-Onkogenamplifikation und dient als prognostischer Biomarker bei verschiedenen Tumorarten. Besonders hervorzuheben ist, dass Medulloblastom in den ersten Fallberichten ausführlich behandelt wurde. ecDNALeider fehlt es in der aktuellen therapeutischen Landschaft für Medulloblastom an hochwirksamen zielgerichteten molekularen Therapien. Die bestehende Standardbehandlung birgt erhebliche Risiken, darunter kognitive Beeinträchtigungen, neurologische Schäden und das Potenzial für sekundäre Malignome.

Medulloblastom wird in vier Hauptmolekularuntergruppen unterteilt: WNT, SHH, Typ 3 und Typ 4. Prognostisch weisen Tumoren mit MYC-Aktivierung im Typ 3 und solche mit TP53-Mutationen in den SHH-Subtypen besonders schlechte Ergebnisse auf. Dies unterstreicht den dringenden Bedarf an innovativen therapeutischen Ansätzen zur Behandlung von Medulloblastomen, angesichts der Herausforderungen, die mit den aktuellen Behandlungsmodalitäten verbunden sind, und der Schwere der Prognose innerhalb spezifischer molekularer Untergruppen.

ecDNA verstärkt den onkogenen Einfluss bei Medulloblastom

In der Untersuchung wurden 102 Fälle von extrachromosomaler DNA (ecDNA) in Tumorproben von 82 Personen identifiziert, was 18 % der 468 untersuchten Patienten ausmacht. Tumoren mit ecDNA-Positivität (ecDNA+) waren bei den Patienten wie folgt verteilt: WNT, 0 von 22 insgesamt; SHH, 30 von 112 (27 %); Typ 3, 19 von 107 (18 %); und Typ 4, 26 von 181 (14 %). Bemerkenswerterweise wiesen Tumoren der SHH-Untergruppe eine höhere Wahrscheinlichkeit auf, ecDNA im Vergleich zu anderen Medulloblastom-Untergruppen zu enthalten.

Innerhalb dieser Kohorte umfassten die in zwei oder mehr Proben beobachteten ecDNA-amplifizierten Gene gut etablierte oder verdächtige Medulloblastom-Onkogene, einschließlich MYC, MYCN, MYCL, TERT, GLI2, CCND2, PPM1D (WIP1) und ACVR2B. Darüber hinaus gehörten Gene, die mit DNA-Reparaturmechanismen assoziiert sind (RAD51AP1 und RAD21), sowie solche, die Inhibitoren des TP53-Weges kodieren (PPM1D28 und CDK6), zu den identifizierten ecDNA-amplifizierten Kandidaten. Diese Ergebnisse werfen ein Licht auf die komplexe genetische Landschaft des Medulloblastomsund betont die potenziellen therapeutischen Implikationen, die mit ecDNA-amplifizierten Onkogenen in dieser Malignität verbunden sind.

Die Landschaft von ecDNA in Tumoren von Medulloblastom-Patienten. (Chapman et al., 2023)

ecDNA als Indikator für eine ungünstige Prognose bei Medulloblastom

Patienten mit Tumoren, die extrachromosomale DNA (ecDNA) zeigten signifikant verringerte fünfjährige Gesamtüberlebens- und progressionsfreie Überlebensraten im Vergleich zu Personen mit ecDNA-negativen (ecDNA-) Tumoren. Besonders das Gesamtüberleben war bei Patienten mit ecDNA+ Tumoren innerhalb der SHH-, Typ 3- und Typ 4-Untergruppen deutlich niedriger (P < 0,05). Um die prognostische Bedeutung von ecDNA weiter zu bewerten, wurde eine Cox-regressionsanalyse durchgeführt, die ergab, dass Personen mit ecDNA+ Tumoren ein erhöhtes prognostisches Risiko und eine höhere Sterblichkeit im Vergleich zu ihren Kollegen mit ecDNA- Tumoren hatten (P < 0,005). Diese Ergebnisse unterstreichen das Potenzial von ecDNA als robusten prognostischen Marker bei Medulloblastomen und heben seine Assoziation mit schlechteren klinischen Ergebnissen hervor.

Assoziation von TP53-Mutationen mit ecDNA bei SHH-Medulloblastom

Das Tumorsuppressorprotein p53, kodiert durch TP53, spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Wahrnehmung von DNA-Schäden, dem Zellzyklus-Stopp und der Apoptose und trifft häufig auf somatische Mutationen und pathogene Keimbahnvarianten bei SHH-Medulloblastom. Um den potenziellen Zusammenhang zwischen TP53-Mutationen und der Präsenz von extrachromosomalem DNA (ecDNA) zu untersuchen, analysierten die Forscher den somatischen und keimzellulären TP53-Mutationsstatus in 92 Fällen von SHH-Medulloblastom.

Bemerkenswert ist, dass TP53-Mutationen in ecDNA+ SHH-Tumoren häufiger vorkamen als in ihren ecDNA- SHH-Gegenstücken. Diese Korrelation war jedoch in anderen Medulloblastom-Subtypen oder in der gesamten Kohorte nicht offensichtlich, was auf eine subtyp-spezifische funktionale Beziehung zwischen TP53-Mutationen und ecDNA hinweist, insbesondere innerhalb des SHH-Subtyps. Die Cox-Regressionanalyse ergab, dass der Einfluss von ecDNA auf das Überleben nicht ausschließlich auf TP53-Mutationen zurückzuführen war. Obwohl aus diesen Daten allein keine definitive Kausalität abgeleitet werden kann, zeigen diese Analysen TP53-Mutationen und ecDNA als klinisch relevante Biomarker für hochaggressive SHH-Medulloblastom-Tumoren auf.

Koexistenz verschiedener ecDNA-Profile in ausgewählten Medulloblastomen

Die Analyse von 16 Medulloblastom-Fällen zeigte das Vorhandensein mehrerer unterschiedlicher extrachromosomale DNA (ecDNA) SequenzenBemerkenswert ist, dass ein primärer SHH-Medulloblastomtumor mit einer heterozygoten TP53-Mutation (RCMB56-ht) ausgewählt wurde, um ein patientenabgeleitetes orthotopisches Xenotransplantat-Mausmodell (RCMB56-pdx) zu etablieren. Detaillierte Whole-Genome-Sequenzierung (WGS) und optische Genomkartierung (OGM) wurden für die Genomassemblierung eingesetzt, um die Existenz eines zirkulären Amplifikons (amp1) zu bestätigen, das aus drei DNA-Fragmenten auf Chromosom 1 besteht. Darüber hinaus wurde ein kontinuierliches Chromatin-Amplifikon (amp2) validiert, das aus 21 Fragmenten auf den Chromosomen 7 und 17 besteht.

Um die Koexistenz dieser unterschiedlichen ecDNA-Profile innerhalb derselben Zellen festzustellen, wurde eine multikanalige Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) der gleichen Marker in Interphase-Zellen durchgeführt. Das Vorhandensein unterschiedlicher fluoreszierender Punkte für jedes Gen im Zellkern derselben Zelle deutete darauf hin, dass jede Kopie des amplifizierten Gens auf einem separaten Chromatin-Körper lokalisiert war. Diese Ergebnisse unterstreichen die komplexe Natur der ecDNA-Diversität innerhalb von Medulloblastomen und bieten wertvolle Einblicke in die komplexe genomische Landschaft von diesen Tumoren.

Unterschiedliche hochkopierte extrachromosomale Amplifikationen koexistieren in einem SHH-Medulloblastomtumor. (Chapman et al., 2023)

Heterogenität der ecDNA-Kopienzahlen bei Medulloblastomen

In dieser Untersuchung etablierten die Forscher eine automatisierte Bildanalyse-Pipeline, um die Verteilung der Kopienzahl pro Zelle in der Interphase-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)-Mikroskopie zu bewerten, mit dem Ziel, die Heterogenität von extrachromosomalem DNA (ecDNA) im Medulloblastom zu quantifizieren. Der Mittelwert und die Varianz der geschätzten Kopienzahlen pro Zelle für alle ecDNA-Amplifikationsmarker-Gene waren deutlich höher im Vergleich zur ecDNA-Zelllinie COLO320-HSR, die das chromosomal amplifizierte MYC-Lokus umfasst. Dies steht im Einklang mit der beobachteten hohen Heterogenität der Kopienzahlen in menschlichen Krebszelllinien mit ecDNA.

Bemerkenswerterweise wiesen in jedem analysierten Primärtumor nur 22%-41% der Zellen eine ecDNA-amplifizierte Kopienzahl von mehr als 5 auf. Erkenntnisse aus quantitativer FISH-Mikroskopie und multichromosomaler Einzelzell-Sequenzierung deuten darauf hin, dass eine Teilmenge von Zellen innerhalb von ecDNA+ Medulloblastomen hochkopierte ecDNAs beherbergt. Darüber hinaus zeigen diese Zellen hochvariable einzelne oder multiple extrachromosomale amplifizierte Kopienzahlen. Diese Ergebnisse unterstreichen die komplexe und dynamische Natur der ecDNA-Kopienzahlvariationen innerhalb der zellulären Landschaft von Medulloblastomen.

Die Einzelzellanalyse zeigt eine distincte Tumorzellpopulation mit hochgradiger ecDNA-Amplifikation. (Chapman et al., 2023)

Einzigartige transkriptomische Profile in ecDNA+ Zellen

Durch die Nutzung des gewichteten nächsten Nachbarn-Algorithmus für das Clustering wurden die meisten ecDNA+-Zellen in distincten Clustern segregiert, die durch einzigartige Merkmale gekennzeichnet sind. transkriptomisch und epigenetische ProfileBemerkenswert ist, dass Zellen innerhalb des ecDNA+-Clusters eine signifikante Überexpression der Marker-Gene amp1 und amp2 DNT IP 2 (Wilcoxon-Rangsummentest, q < 0,001) und KMT2E (q < 0,001) zeigten. Darüber hinaus war GLI2 (q < 0,001) im ecDNA+-Zellcluster im Vergleich zu anderen Tumor- und normalen Zellen deutlich hochreguliert. Die transkriptionale Aktivität von ecDNA-amplifizierten Genen zeigte eine positive Korrelation mit zunehmenden ecDNA-Kopienzahlen.

Um diese Ergebnisse zu kontextualisieren, wurden normale Zelltypen durch cluster-spezifische Expression bekannter Marker-Gene identifiziert. Die genomische Schätzung der Kopienzahl durch Einzelkern-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq) bestätigte, dass normale Zellen ein stabiles Genom aufwiesen, im Gegensatz zu Tumorzellclustern, die eine Vielzahl von Kopienzahlveränderungen zeigten. Diese Ergebnisse heben die distinct molekulare Landschaft von ecDNA+-Zellen hervor und betonen ihre einzigartigen transkriptionalen Signaturen sowie die zugrunde liegenden genomischen Veränderungen im Vergleich zu Tumor- und normalen Zellen.

ecDNA orchestriert die Platzierung von Onkogenen innerhalb einer abnormen genetischen Regulierungslandschaft.

Angesichts der tiefgreifenden genomischen Umstrukturierungen, die mit medulloblastoma ecDNA verbunden sind, untersuchte die Studie, ob abnormale DNA-Interaktionen zwischen ko-amplifizierten Onkogenen und Enhancern im Kontext von zirkulärer ecDNA auftreten. Um dies zu erforschen, wurde zugängliche Chromatin-Proben von 25 Medulloblastom-Tumoren einer Analyse unterzogen durch ATAC-seq, während Chromatin-Interaktionen von 17 Tumoren mithilfe der Chromatin-Konformationsfängung (Hi-C) untersucht wurden.

In der Hälfte der untersuchten ecDNA+ Tumoren (D458, MB106, MB268 und RCMB56) wurden überzeugende Beweise für abnormale Chromatin-Interaktionen auf ecDNA identifiziert, die sich über strukturell variable Bruchstellen erstreckten. Diese Interaktionen ermöglichten die Nähe von zugänglichen Motiven und ko-amplifizierten Genen, die aus distalen genomischen Regionen stammten. Hi-C-Daten zeigten zudem, dass der MYC-Promotor Interaktionen mit Chromosom 8 und ko-amplifizierten regulatorischen Elementen auf Chromosom 14 aufwies.

Diese Ergebnisse unterstreichen die Häufigkeit abnormaler Interaktionen zwischen Enhancern und Promotoren, die aus strukturellen Umstellungen von ecDNA in Medulloblastom-Tumoren entstehen. Die Studie beleuchtet die komplexen regulatorischen Dynamiken, die von ecDNA orchestriert werden, und liefert wertvolle Einblicke in die molekularen Grundlagen der Medulloblastom-Pathogenese.

Chromatin-Interaktionen mit MYC sind in einem Gruppe-3-Medulloblastom neu verdrahtet. (Chapman et al., 2023)

Enhancer-vermittelte Regulation der Onkogen-Transkription durch ecDNA-Amplifikation

Ein umfassendes CRISPRi-Verstärkungsscreening wurde in der Medulloblastom-Zelllinie D458 vom Typ 3 durchgeführt, wobei 32.530 sgRNA-Sequenzen verwendet wurden, die 645 zugängliche Stellen auf extrachromosomalem DNA (ecDNA) anvisierten. Der gleiche Screening-Ansatz wurde auf die Zelllinie D283 vom Typ 3 angewendet, die durch eine MYC-Amplifikation innerhalb einer 55 Mbp gleichmäßig gefärbten Region des Chromosoms 8q gekennzeichnet ist. Während der MYC-Promotor in beiden Zelllinien als wesentlich erwiesen wurde, identifizierte das Screening sechs funktionale Elemente, die speziell die Proliferation von D458 nach 21 Tagen CRISPRi-Hemmung behinderten.

Zusätzliche Erkenntnisse aus dem Hemmungs-Screen verdeutlichten, dass, obwohl die MYC-Amplifikation die Proliferation in allen Typ-3-Medulloblastom-Zelllinien vorantreibt, die relative Bedeutung koamplifizierter Gene und cis-regulatorischer Elemente je nach genomischer Struktur des Amplifikats variierte. Dies hebt das nuancierte Zusammenspiel zwischen amplifizierten Onkogenen und den zugehörigen regulatorischen Elementen hervor und beleuchtet die komplexe Landschaft der transkriptionalen Kontrolle von Onkogenen, die durch die ecDNA-Amplifikation im Medulloblastom orchestriert wird.

Die Umgestaltung von Enhancern in medulloblastomassoziierter ecDNA beeinflusst die Zellproliferation. (Chapman et al., 2023)

Referenz:

1. Chapman, O.S., Luebeck, J., Sridhar, S. u. a. Zirkuläre extrachromosomale DNA fördert die Tumorheterogenität bei hochriskantem Medulloblastom. Nat Genet 55, 2189–2199 (2023).