Reduziertes Repräsentations-Bisulfid-Sequenzierungsprotokoll (RRBS)

MspI Verdau von genomischer DNA

Fügen Sie 100 ng (in 25 μL) genomische DNA zu einem 0,2-mL-Röhrchen hinzu und halten Sie den Acht-Röhrchen-Streifen auf Eis.
2. Bereiten Sie einen Mastermix aus 10 Buffer Tango (3 μL) und MspI (10 U/μL) (2 μL) vor und halten Sie den Mastermix auf Eis. Fügen Sie 5 μL des Mastermix zu dem 0,2-mL-Röhrchen mit genomischer DNA hinzu. Mischen Sie durch Pipettieren und verschließen Sie den Acht-Röhrchen-Streifen mit einem Acht-Kappen-Streifen.
3. Platzieren Sie den Acht-Röhrchen-Streifen (0,2 mL) auf einem Thermocycler und führen Sie das folgende Temperaturprogramm für die MspI-Spaltung aus: 37 °C für 120 Minuten; halten bei 4 °C (beheizter Deckel 50 °C).

Endreparatur und dA-Tailing

1. Zentrifugieren Sie den Acht-Röhrchen-Streifen (0,2 mL) mit MspI-digested DNA. Entfernen Sie den Acht-Kappen-Streifen vorsichtig, ohne die DNA-Lösung in den Röhrchen zu spritzen. Halten Sie den Acht-Röhrchen-Streifen auf Eis. Fügen Sie 1 μL dNTP-Mix für RRBS und 1 μL Klenow-Fragment (exo-) zu jedem Röhrchen hinzu und mischen Sie durch Pipettieren (insgesamt 32 μL). Verschließen Sie die Röhrchen mit einem neuen Acht-Kappen-Streifen.
2. Legen Sie den Acht-Röhrchen-Streifen (0,2 mL) auf einen Thermocycler und führen Sie das folgende Temperaturprogramm aus: 30 °C für 20 Minuten und 37 °C für 20 Minuten; halten Sie bei 4 °C (erhitzter Deckel 50 °C).
Fügen Sie 64 μL (2 Volumina) AMPure XP-Perlen zur DNA-Lösung hinzu. Führen Sie die Reinigung mit AMPure XP-Perlen durch und eluieren Sie die DNA mit 18 μL 10-mM Tris–Cl (pH 8,5). Übertragen Sie 17,7 μL der eluierenden DNA-Lösung in einen neuen Acht-Röhrchen-Streifen (0,2 mL).

Adapter-Ligation

1. Halten Sie die eluierte DNA in dem Acht-Röhrchen-Streifen (0,2 mL) auf Eis. Fügen Sie 2,3 μL NEBNext Ultra II End Prep Reaktionspuffer zur eluierte DNA (insgesamt 20,0 μL) hinzu.
2. Bereiten Sie einen Mastermix für NEBNext Ultra II Ligation Master Mix (10,0 μL) und NEBNext Ligation Enhancer (0,33 μL) vor, die beide in Reagenz 5 in Abschnitt 2.1 enthalten sind. Mischen Sie den Mastermix, indem Sie zehnmal auf und ab pipettieren. Fügen Sie 10,33 μL des Mastermix zu eluiertem DNA hinzu und mischen Sie, indem Sie drei Mal auf und ab pipettieren. Fügen Sie 0,83 μL von NEBNext Methylated Adaptor (2 μM) zu jedem Röhrchen hinzu und mischen Sie, indem Sie zehnmal auf und ab pipettieren (insgesamt 31,16 μL). Decken Sie den Acht-Röhrchen-Streifen mit einem neuen Acht-Kappen-Streifen ab.
3. Platzieren Sie den Acht-Röhrchen-Streifen auf einem Thermocycler und führen Sie das folgende Temperaturprogramm aus: 20 °C für 60 Minuten; halten bei 4 °C (erhitzter Deckel 50 °C). Nach dem Entfernen des Acht-Kappen-Streifens den Acht-Röhrchen-Streifen auf Eis aufbewahren. Fügen Sie 1 μL Uracil-spezifisches Exzisionsreagenz-Enzym hinzu, mischen Sie durch Pipettieren und decken Sie den Acht-Röhrchen-Streifen mit einem neuen Acht-Kappen-Streifen ab. Platzieren Sie die Röhrchen auf einem Thermocycler und führen Sie das folgende Temperaturprogramm (Programm D) aus: 37 °C für 15 Minuten; halten bei 4 °C (erhitzter Deckel 50 °C). Lagern Sie die Röhrchen mit dem adapter-ligierten DNA bei -20 °C bis zum nächsten Tag.
4. Fügen Sie 48 μL (1,5 Volumen) AMPure XP-Perlen zur DNA-Lösung hinzu. Führen Sie die Reinigung mit AMPure XP-Perlen durch und eluieren Sie die DNA mit 20 μL 10-mM Tris–Cl (pH 8,5).

Bisulfit-Konversion von Adapter-ligiertem DNA

1. Führen Sie die Bisulfit-Konversion von mit Adaptern ligiertem DNA unter Verwendung des EZ Methylation Gold Kits durch. Das erforderliche Temperaturprogramm für die Bisulfit-Konversion beträgt 98 °C für 10 Minuten und 64 °C für 150 Minuten, anschließend bei 4 °C halten (erhitzter Deckel 105 °C). Fügen Sie 130 μL des CT-Konversionsreagenz zu der mit Adaptern ligierten, gereinigten DNA (20 μL) hinzu und teilen Sie die Lösung auf zwei 0,2-mL-Röhrchen (je 75 μL) auf. Platzieren Sie die Acht-Röhrchen-Streifen auf einem Thermocycler und starten Sie das Programm. Nach Abschluss kombinieren Sie die beiden Aliquote von 75 μL in einem Röhrchen. Führen Sie die nachfolgenden Verfahren gemäß dem Protokoll des Herstellers des EZ Methylation Gold Kits durch. Eluieren Sie die bisulfit-konvertierte DNA mit 11 μL M-Elutionspuffer.

PCR-Amplifikation

1. Übertragen Sie 10,0 μL der mit Bisulfit behandelten DNA in ein 0,2-mL-Röhrchen. Fügen Sie 1,25 μL des i7-Primer (10 μM) und 1,25 μL des i5-Primer (10 μM) zur mit Bisulfit behandelten DNA hinzu und mischen Sie kurz. Fügen Sie 12,5 μL des 2 KAPA HiFi Hot Start Uracil+ Ready Mix hinzu und mischen Sie durch Pipettieren (insgesamt 25,0 μL).
2. Führen Sie die PCR-Amplifikation unter den folgenden thermischen Zyklen (Programm F) durch: 98 °C für 45 s für die initiale Denaturierung, neun Zyklen von 98 °C für 15 s, 60 °C für 30 s und 72 °C für 30 s zur Amplifikation sowie 72 °C für 1 min zur finalen Extension; halten Sie bei 4 °C (erhitzter Deckel 105 °C). Die amplifizierten DNA-Proben können über Nacht bei 4 °C in einem Thermocycler aufbewahrt oder länger bei -20 °C gelagert werden.

Bibliotheksqualitätskontrolle

1. Bei Verwendung des Hochsensitivitäts-DNA-Kits wird jeweils 1 μL der gereinigten RRBS-Bibliotheken einer mikrokapillaren elektrophoretischen Analyse unterzogen.
2. Messen Sie die Molarität jeder Bibliothek (für den Bereich von 200 bp bis 1000 bp). Überprüfen Sie die Fragmentgrößenverteilung jeder Bibliothek.

Sequenzierung

1. Testsequenzierung auf der MiSeq-Plattform und Anpassung der DNA-Konzentration der Bibliothek: Bereiten Sie mehr als 2 μL einer 2-nM-Lösung für jede Bibliothek vor. Mischen Sie 2 μL jeder der 2-nM-Bibliotheken (insgesamt 16 μL im Falle von acht Bibliotheken). Für eine Testsequenzierung mit einem MiSeq Reagent Nano Kit v2 (300 Zyklen) mischen Sie 92 μL von 10-mM Tris–Cl (pH 8,5), 2 μL des 2-nM-Bibliothekspools und 1 μL der 1-nM PhiX Control v3 Bibliothek (insgesamt 95 μL) in einem 1,5-mL-Röhrchen. Fügen Sie 5 μL von 2-N NaOH zur 95-μL-Mischung hinzu, mischen Sie durch Vortexen und lassen Sie das Röhrchen 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen, um die DNA-Mischung der Bibliothek zu denaturieren. Fügen Sie 500 μL kaltes Puffer A hinzu, mischen Sie und halten Sie die Lösung 5 Minuten lang auf Eis. Die endgültige Konzentration der denaturierten Bibliothekslösung (insgesamt 600 μL), einschließlich 20% des Spike-in PhiX Control v3 Bibliothek zur Farbangleichung bei niedriger Nukleotidvielfalt, beträgt 8,3 pM. Führen Sie die Testsequenzierung auf einer MiSeq-Plattform unter Verwendung des Generate FASTQ-Workflows durch.
2. Nach Abschluss des MiSeq-Laufs überprüfen Sie die Indexverhältnisse der RRBS-Bibliotheken und berechnen Sie die Konzentration der Bibliotheken entsprechend den Indexverhältnissen neu.
3. Führen Sie eine Vollsequenzierung auf der HiSeq X-Plattform durch. Bereiten Sie einen Pool von RRBS-Bibliotheken vor, der für die Sequenzierung ausreichend ist.