Richtlinien zur Einreichung von Proben
MeRIP-Sequenzierung Fragen und Antworten
Allgemeine Fragen
- Kann die meRIP-seq m6A-Modifikationen von RNA untersuchen?
- Absolut. Derzeit werden m6A-Modifikationen in RNA hauptsächlich untersucht durch MeRIP-seq.
- Kann m6A in Verbindung mit circ RNA analysiert werden?
- Ja, das können wir. Wir können eine Bibliothek nur für circRNA erstellen, um 5 µg zirkulärer RNA für die Anreicherung zu sammeln.
- Ist es wahr, dass m6A-seq nicht mehr als 3 Proben pro Gruppe benötigt und es in Ordnung ist, m6A ohne Duplikate und nur einmal pro Probe durchzuführen?
- Außer bei Zelllinienproben, die nur mit 2 Replikaten durchgeführt werden können (normalerweise für zwei verschiedene shRNA- oder siRNA-Methoden), sind in der Regel selbst primäre Zellen drei biologische Replikate.
- Warum werden die Gene von Chloroplasten und Mitochondrien in MeRIP-Daten verglichen?
- Der Aufbau der MeRIP-Bibliothek basiert auf der Menge an mRNA, um die Art des Bibliotheksaufbaus zu bestimmen. Wenn Chloroplasten- und Mitochondriengene in den MeRIP-Daten übereinstimmen, handelt es sich wahrscheinlich um ein Problem bei der Extraktion. Es gibt keinen guten Weg, Mitochondrien und Chloroplasten zu entfernen; der einzige Weg besteht darin, das Sequenzierungsvolumen zu erhöhen, um die gültigen Daten zu steigern.
- Sind MeRIP und RIP ähnlich?
- MeRIP (auch bekannt als m6A-IP) und RIP unterscheiden sich darin, dass sie unterschiedliche experimentelle Zwecke haben: Ersteres misst den m6A-Spiegel eines Gens, während letzteres die an ein Leseprotein gebundene mRNA nachweist. Der m6A-Antikörper kann theoretisch jede RNA mit m6A-Modifikation mit 99% Spezifität binden, und es gibt keine unspezifische Anreicherung.
- Wie man MeRIP-seq-Experimente entwirft?
- • Proben: Zellen, Gewebe, totale RNA nach der Extraktion (beschränkt auf Arten mit Referenzgenom).
• Gruppierung: Zellmodell: Experimentalgruppe und Kontrollgruppe, 3:3 empfohlen
• Gewebe: normale Gruppe und Krankheitsgruppe, 5:5 empfohlen
• Intra-Gruppe Kontrolle: IP-Gruppe und Eingangsgruppe
- • Proben: Zellen, Gewebe, totale RNA nach der Extraktion (beschränkt auf Arten mit Referenzgenom).
- Muss ich nach der RNA-Anreicherung im MeRIP-seq unterbrechen?
- Es ist möglich, zu unterbrechen oder nicht zu unterbrechen. Wenn Sie unterbrechen möchten, stellen Sie bitte sicher, dass das Ziel nur mRNA ist oder lncRNA Bevor Sie unterbrechen. Wenn es sich nur um mRNA handelt, können Sie zunächst Oligo dT-Perlen verwenden, um sie anzureichern, und sie dann unterbrechen. Wenn sowohl lncRNA als auch mRNA untersucht werden sollen, sollte die rRNA der Gesamt-RNA vor der Unterbrechung mit dem Kit abgebaut werden.
- Wie man die RNA von m6A-Antikörper eluieren kann, wenn mein RNA-Volumen niedrig ist.
- Wenn die Ausgangsmenge an RNA niedrig ist, kann das Elutionsvolumen (Elutionspuffer) um 25-30 % erhöht und die Anzahl der Elutionen von 2 auf 4-6 Mal erhöht werden.
- Wie man die RNA nach der Immunpräzipitation (IP) extrahiert?
- RNA aus IP kann durch die Verwendung von Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol im Volumenverhältnis 25:24:1 oder durch direkte Zugabe von Trizol-Reagenz extrahiert werden.
- Was ist Ihr Prozess zum Erstellen und Sequenzieren von MeRIP-seq-Bibliotheken?
- Jedes MeRIP-seq-Set besteht aus zwei Arten von Proben, der Immunpräzipitationsprobe (IP) und der Input-Kontrollprobe. Die RNA-Moleküle werden zunächst in Fragmente von 100-200 nt zerlegt. Die IP-Probe liefert eine unvoreingenommene Messung des methylierten RNA-Fragmentes mittels eines spezifischen Anti-m6A-Antikörpers. Gleichzeitig spiegelt die Input-Kontrollprobe die Häufigkeit der basalen RNA wider. Die Lokalisierung des gesamten Transkriptom-m6A erfolgt durch den Aufbau der Bibliothek, Hochdurchsatz-Sequenzierung und bioinformatische Analyse.
- Welche MeRIP-seq-Analyse-Dienstleistungen bieten Sie an?
Grundanalyse Fortgeschrittene Analyse Bewertung der Datenqualität von Sequenzierungen Differenzielle Expressionsanalyse von methylierten Genen Qualitätskontrolle Analyse der Anreicherung von GO-Funktionen bei differentieller Methylierung von Genen Genomabdeckungsanalyse Differenzielle Methylierung Gene KEGG-Pfad-Analyse Identifizierung von m6A-Spitzen Analyse der Reaktomwege bei differentieller Methylierung von Genen m6A-Spitzenmerkmale-Annotation Differenzielle Expressionsanalyse von methylierten lncRNAs m6A mRNA-Analyse GO-funktionelle Anreicherungsanalyse von differentiell methylierten lncRNAs cis-kodierenden Genen Motivanalyse von methylierten mRNAs KEGG-Pfad-Analyse von cis-codierenden Genen differenziell methylierten lncRNAs m6A lncRNA-Analyse Reactome-Pfad-Analyse von cis-encodegenen, die differentially methylierten lncRNAs zugeordnet sind. Motivanalyse von methyliertem lncRNA Differenzielle Expressionsanalyse von methylierten circRNAs Analyse der Erkennung und Identifizierung von circRNA GO-funktionelle Anreicherungsanalyse von unterschiedlich methylierten circRNA-Hostgenen m6A mRNA Anreicherungsanalyse von circRNA KEGG-Pfad-Analyse von unterschiedlich methylierten circRNA-Host-Genen Motivanalyse von methyliertem circRNA Reactome-Pfad-Analyse von unterschiedlich methylierten circRNA-Hostgenen
- Was sind die nachfolgenden experimentellen Validierungen von MeRIP-seq?
- MeRIP-qPCR. Nach der Anreicherung von RNA mit Methylierungsmodifikationen unter Verwendung von m6A-Antikörpern besteht der nächste Schritt darin, die angereicherte RNA direkt mittels qPCR zu quantifizieren. Es wird empfohlen, dies mit der Genexpressions-RT-qPCR, WB und anderen Validierungsmethoden zu kombinieren, um die Testergebnisse zu überprüfen.
- Ist es notwendig, MeRIP-seq zusätzlich zur normalen Transkriptom-Sequenzierung durchzuführen?
- Nein, Eingabedaten können wie gewohnt analysiert werden. Whole-Transcriptom-Sequenzierungsdaten.
- Warum ist es notwendig, sowohl Input- als auch IP-Proben für MeRIP-seq durchzuführen?
- Im MeRIP-seq-Experimentaufbau bilden Input und IP ein Paar von Proben. Die IP-Proben sind speziell mit m6A-Antikörpern für methylierungsmodifizierte RNA-Fragmente angereichert, während Input lediglich fragmentierte RNA als Kontrolle zur Reduzierung von Hintergrundgeräuschen ist. Der Aufbau der Bibliothek und die Sequenzierung erfolgen parallel. Die kombinierte Peak-Detektionsanalyse erfordert die Integration von Daten aus beiden Proben und die Verwendung von Input-Daten, um Peaks mit hohen Hintergrundexpressionsniveaus oder unspezifischer Bindung auszuschließen, um die Genauigkeit der Peak-Bestimmung zu verbessern.
- Gibt es Artenbeschränkungen für die Durchführung von MeRIP-seq?
- Wenn nicht menschlich, werden Maus- und Rattenarten empfohlen, um zu sein. konsultiert Zuerst. Allgemein können Arten mit Referenzgenom, Genomverknüpfung auf Chromosomenebene und vollständigen GTF-Annotationsdateien bearbeitet werden; eukaryotische, prokaryotische oder virale Projekte werden empfohlen, um zuerst bewertet zu werden, da es Unterschiede in der Software und den Parametern gibt, die an der Erkennung von Bindungsspitzen beteiligt sind.
Probenvorbereitung
- Was sind die Anforderungen an die Probenlieferung für MeRIP-seq?
- • Probenart: Zelle, Gewebe, Gesamt-RNA
• Konventionelles MeRIP-seq: Gesamt-RNA ≥ 25 μg nach Dnase-Digestion, Konzentration ≥ 100 ng/μg, RIN ≥ 8.
• Andere Arten: Gesamt-RNA ≥ 150 μg, Konzentration ≥ 100 ng/μg, RIN ≥ 8
- • Probenart: Zelle, Gewebe, Gesamt-RNA
- Ist es besser, RNA direkt oder cDNA für MeRIP-seq zu verwenden?
- Nachdem die gesamte RNA extrahiert wurde, geben Sie sie in NF-Wasser und lagern Sie sie bei -80 °C für mindestens 2-4 Wochen. Wenn eine mRNA-Anreicherung für die gesamte RNA durchgeführt wird, führen Sie das Experiment bitte sofort innerhalb von 2 Tagen durch, da die mRNA sonst stark abgebaut wird.
Was cDNA betrifft, wird bei einer Langstreckensendung nicht empfohlen, RNA zu versenden oder hauptsächlich cDNA zu versenden. In diesem Fall können Sie das Produkt aus Input und IP rücktranskribieren und in NF-Wasser für den Transport mit Trockeneis aufbewahren.
- Nachdem die gesamte RNA extrahiert wurde, geben Sie sie in NF-Wasser und lagern Sie sie bei -80 °C für mindestens 2-4 Wochen. Wenn eine mRNA-Anreicherung für die gesamte RNA durchgeführt wird, führen Sie das Experiment bitte sofort innerhalb von 2 Tagen durch, da die mRNA sonst stark abgebaut wird.
Nur für Forschungszwecke, nicht zur klinischen Diagnose, Behandlung oder individuellen Gesundheitsbewertung bestimmt.
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