Richtlinien zur Probenvorbereitung für Long-Read-Sequenzierung

Richtlinien zur Einreichung von DNA-Proben

Zelllinien

Sammeln Sie kultivierte Wandzellen oder Suspensionszellen, entfernen Sie das Kulturmedium; waschen Sie 1-2 Mal schnell mit PBS, entfernen Sie PBS durch Niedriggeschwindigkeitszentrifugation; übertragen Sie die Zellen in enzymefreie 1,5 ml EP-Röhrchen, zentrifugieren Sie, um das Überstand zu entfernen, und lagern Sie sie in flüssigem Stickstoff oder im -80 °C Kühlschrank zum Schnelleinfrieren und Transport auf Trockeneis.

Hinweis: ≥5×10⁷ Zellen sind pro Bibliothek erforderlich. Der DNA-Ertrag verschiedener Zelltypen variiert. Im Allgemeinen ist der DNA-Ertrag größerer Zellen, wie Myofibroblasten und Neurofibroblasten, etwas geringer, und das Zellvolumen kann entsprechend erhöht werden.

Blut

Frische Vollblutproben werden direkt mit EDTA-antikoagulierten Blutentnahmeröhrchen entnommen, 10 Mal sanft durch Inversionen gemischt und anschließend in flüssigem Stickstoff oder einem -80 °C Kühlschrank gelagert und nach der Antikoagulation auf Trockeneis versendet.

Hinweis:

• Erythrozyten-nukleiertes Blut: ≥500 μl Vollblut pro Bibliothek.
• Erythrozyten-nukleierte Blut: ≥1,5 ml Vollblut pro Bibliothek.
• Die DNA-Ausbeute variiert stark zwischen Arten und Individuen, wobei Erythrozyten von Vögeln oder Fischen Kerne enthalten und eine etwas höhere DNA-Ausbeute aufweisen, während Erythrozyten aus menschlichem und säugetierlichem Blut keine Kerne haben und eine niedrigere DNA-Ausbeute aufweisen, sodass das Probenvolumen entsprechend erhöht werden sollte.

Tiergewebe

1. Frische Gewebeproben, die von lebenden Organismen entnommen wurden (oder innerhalb von 10 Minuten nach dem Tod des Organismus), wurden ausgewählt und so schnell wie möglich nach der Entnahme mit vorgekühlter Kochsalzlösung oder PBS gespült, um Blutflecken und Schmutz zu entfernen.
2. Binde- und Fettgewebe sowie andere Gewebetypen, die für die Studie nicht erforderlich waren, wurden schnell auf Eis entfernt, und die Proben wurden in kleine Stücke von etwa 30-50 mg (der Größe eines grünen Bohnenkorns; je kleiner das Gewebe, desto besser der Erhaltungseffekt) zerlegt.
3. Abgetrocknet und in enzymfreien 1,5 / 2,0 ml EP-Röhrchen oder Zentrifugenröhrchen platziert.
4. Nach dem Schnelleinfrieren in flüssigem Stickstoff oder einem -80°C Kühlschrank lagern und auf Trockeneis transportieren.
5. Hinweis:

• Jede Bibliothek benötigt ≥1,5 g tierisches Gewebe.
• Der DNA-Ertrag variiert stark zwischen verschiedenen Gewebearten, z. B. ist der DNA-Ertrag bei metabolisch aktiven Lebergeweben höher und bei Muskelgeweben niedriger, was nicht empfohlen wird.
• Für Fisch und Geflügel werden Blut- oder Leberproben empfohlen.

Pflanzenproben

Es wird empfohlen, frische Gewebeproben zu verwenden, die mit 70% Ethanol oder sterilem Wasser gespült, trocken getupft, in flüssigem Stickstoff oder einem -80°C Kühlschrank gelagert und dann in vorgekühlte 50 ml Zentrifugenröhrchen gegeben oder in Alufolie gewickelt und in selbstverschließbare Beutel gelegt und auf Trockeneis versendet werden. Für jede Bibliothek sind mehr als 2 g erforderlich.

Mikroalgen

Frische Algen werden gesammelt, in enzymfreie 1,5 ml EP-Röhrchen transferiert, einmal mit einer 0,3 M EDTA-Lösung oder 70% Ethanol gewaschen, der Überstand entfernt, sofort in flüssigem Stickstoff oder einem -80 °C Kühlschrank eingefroren und auf Trockeneis versendet. Für jede Bibliothek werden mehr als 2 g benötigt.

Mikrobielle Proben

Bakterien, einschließlich Pilzen, Actinobakterien und Bakterien, sollten aus den logarithmischen Wachstumsphasen gesammelt, von dem Kulturmedium und anderen Verunreinigungen befreit, in 1,5 ml EP-Röhrchen ohne Enzyme überführt, in flüssigem Stickstoff oder im -80 °C Gefrierschrank schockgefrostet und auf Trockeneis transportiert werden. Für jede Bibliothek sind mehr als 2 g erforderlich.

RNA PROBENEINREICHUNGSRICHTLINIEN

Zelllinien

Sammeln Sie die Suspension oder die wandlosen Zellen in enzymfreien EP-Röhrchen/Zentrifugenröhrchen und entfernen Sie das Überstand durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit. 1 × 10⁵-10⁷ Zellen plus 1 ml TRIzol-Reagenz, lysieren durch wiederholtes Blasen, um Verklumpungen zu vermeiden, 5-10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um vollständig in ein Homogenat zu lysieren, dann bei -80 °C einfrieren und auf Trockeneis transportieren.

Blut

Es wird empfohlen, Vollblut zu isolieren und mit speziellen Blut-RNA-Röhrchen zu transportieren, die spezifische Reagenzien zur RNA-Fixierung enthalten, die RNA-Moleküle vor dem Abbau durch RNA-Enzyme schützen und die Veränderungen der Genexpression in vivo minimieren.

2. Frisches Blut wird in Blut-RNA-Röhrchen gesammelt, die jeweils 2,5 ml Blut enthalten (a, erythroide nukleierte Blutzellen: ≥2,5 ml Vollblut pro Bibliothek; b, erythroide anukleierte Blutzellen: ≥5 ml Vollblut pro Bibliothek).

3. Sanft umgedreht und 8-10 Mal sofort nach der Entnahme gemischt.

4. Aufrecht bei Raumtemperatur für 2 - 72 Stunden gelagert und auf Trockeneis transportiert.

5. Nach 2 - 72 Stunden auf Trockeneis transportieren.

Tiergewebe

1. In vivo entnommene Gewebeproben werden mit RNase-freiem Kochsalz oder PBS gespült, um Blutspuren und Schmutz zu entfernen. Die Proben werden in kleine Stücke von etwa 30-50 mg zerteilt, in flüssigem Stickstoff für das Schnelleinfrieren eingetaucht, nach gründlichem Einfrieren in enzymefreien EP-Röhrchen oder Zentrifugenröhrchen aufbewahrt, in flüssigem Stickstoff oder bei -80°C gelagert und auf Trockeneis transportiert.

2. Wenn die TRIzol-Lyse-Lösung zur Konservierung der gesendeten Proben verwendet wird, wird zunächst flüssiger Stickstoff zu Pulver gemahlen, dann wird TRIzol zur Lyse hinzugefügt, die Referenzdosierung beträgt 50-100 mg/ml TRIzol. Nach 5 Minuten Lyse bei Raumtemperatur erfolgt die Einlagerung bei -80 °C und der Transport mit Trockeneis.

3. Wenn RNAlater verwendet wird, befolgen Sie die Anweisungen von RNAlater. Halten Sie die Gewebeprobengröße bei 5 mm, zu klein ist nicht förderlich für die Probenentnahme, zu groß kann die Schutzlösung nicht gleichmäßig im Gewebe eindringen.

Pflanzenproben

Es wird empfohlen, frische Gewebeproben zu verwenden. Nach der Probenentnahme sollte das Material schnell mit RNase-freiem DEPC-H gespült werden.₂O oder 75 % Ethanol, um Staub und Schmutz von der Oberfläche des Materials zu entfernen, trocken tupfen und die Probe in kleine Stücke von etwa 50-100 mg teilen, in flüssigem Stickstoff schnell einfrieren, in RNase-freie EP-Röhrchen oder Zentrifugenröhrchen geben, etwa 500 mg pro Röhrchen, bei -80 °C einfrieren und auf Trockeneis transportieren. Für jede Bibliothek werden mehr als 3-4 g frisches Pflanzengewebe benötigt.

Mikroalgen

Nach dem Sammeln frischer Algen, übertragen Sie diese in enzymefreie 1,5 ml EP-Röhrchen und waschen Sie einmal mit RNAse-freiem 0,3 M EDTA-Lösung oder 70% Ethanol, um das Überstand zu entfernen. Jede Bibliothek benötigt ≥3 g Algen.

Mikrobielle Proben

Festes Medium für Pilze, versiegelt mit einer Versiegelungsfolie und bei Raumtemperatur transportiert. Für in flüssigem Medium kultivierte Pilze die Pilze in Zentrifugenröhren zentrifugieren und sofort in flüssigem Stickstoff schockgefrieren, bei -80 °C lagern und auf Trockeneis transportieren. Ungefähr zwei 90 mm Plattenvolumina/50 ml frisch kultivierte Pilzkörper sind pro Bibliothek erforderlich.