Hybride metagenomische Assemblierung für NGS und Langzeit-Sequenzierung findet Schlüssel zur Mikrobiomforschung

Während metagenomische Sequenzierung ist zu einem wichtigen Werkzeug geworden, die Identifizierung genomischer und funktioneller Wege innerhalb des Mikrobioms bleibt jedoch aufgrund der Einschränkungen, die mit kurzen (~300 bp) Reads verbunden sind, eine Herausforderung bei der Next-Generation-Sequenzierung. Langzeit-Sequenzierung, wie zum Beispiel Nanoporen-Sequenzierung (ONT), wird erwartet, dass sie diese Schwierigkeiten umgeht, indem sie längere Reads (>3 Kilobasenpaare) bereitstellt. Long-Read-Sequenzierung hilft, intergenomische Wiederholungen zu überbrücken und eine bessere de-novo-Assemblierung von Genomen zu erzeugen. Solche hybriden metagenomischen Assemblierungen, die Daten von Kurz- und Lang-Reads verwenden, wurden in Studien zum menschlichen Mikrobiom und in metagenomischen Studien in verschiedenen komplexen Umgebungen eingesetzt. Einige Fälle sind unten aufgeführt.

OPERA-MS, ein hybrider metagenomischer Zusammensteller

Der OPERA-MS-Prozess, der zunächst MEGAHIT, metaSPAdes oder IDBA-UD für die Assemblierung kurzer Sequenzen verwendet, nutzt dann lange Sequenzen, um das genomische Gerüst aufzubauen, und gruppiert anschließend die Gencluster bakterieller Subarten. Anschließend wird die Assemblierungsfähigkeit bewertet.

OPERA-MS, das metagenomische Clusterbildung mit wiederholungsbewusster Clusterbildung kombiniert, kann komplexe bakterielle Gemeinschaften genau assemblieren. Die Autoren fanden heraus, dass OPERA-MS genauere Basenpaare als der Langsequenz-Assembler (Canu) und kohärentere Assembly-Ergebnisse als die Kurzsequenz-Assembler (MEGAHIT23, metaSPAdes24, IDBA-UD25) erzeugte und niedrigere Fehlerraten als der nicht-metagenomische Hybrid-Assembler (hybridSPAdes) aufwies. Der Prozess kann auch in Anwesenheit mehrerer bakterieller Isoformen assemblieren. OPERA-MS kann hochwertige Genome von spärlichen Arten (<1%) bei einer Langsequenzabdeckung von 9× und nahezu vollständige Genome bei höherer Abdeckung assemblieren.

Workflow von OPERA-MS (Bertrand D) u. a. 2019)

Hybride Assemblierung von Metagenomen ermöglicht eine hochpräzise Analyse von Resistenzgenen und mobilen Elementen.

Die Analyse der Mikrobiomzusammensetzung wurde durch Hochdurchsatz-Metagenom-Sequenzierung erreicht. Bestehende Methoden sind jedoch nicht darauf ausgelegt, gemischte Sequenzen aus kurzen und langen Lese-Längen zusammenzusetzen. Die Forscher verwendeten die OPERA-MS Hybrid-Metagenom-Assemblierungssoftware, die die Assemblierung mithilfe von wiederholungsbewusster Clusterung und präzisen Gerüstmethoden kombiniert, um eine präzise Assemblierung komplexer Gemeinschaften zu erreichen.

Forscher sammelten 197 klinische Proben von im Darm kolonisierten carbapenem-resistenten Enterobacteriaceae für die Metagenom-Sequenzierung mit langen und kurzen Reads. Das intestinale Metagenom von 28 antibiotikabehandelten Patienten wurde mit OPERA-MS assembliert und zeigt, dass die Kombination von Daten mit Nanopore-Langreads zu zusammenhängenderen Assemblierungen führt (eine 200-fache Verbesserung gegenüber Kurzread-Assemblierungen), einschließlich über 80 schleifenbildenden Plasmid- oder Phagen-Sequenzen und einem neuen 263 kbp großen Riesenphagen. Hochwertige Hybrid-Assemblierungssoftware ermöglicht eine detaillierte Betrachtung des intestinalen Antibiotikaresistenz in menschlichen Patienten.

Mobile Elemente und ihre Assoziation mit Wirtsspezies im menschlichen Mikrobiom (Bertrand D) u. a. 2019)

Hybride metagenomische Assemblierung verbindet die Kohlenhydratstruktur mit der Funktion im menschlichen Mikrobiom.

Die mikrobielle Vielfalt innerhalb der Mikrobiota und ihre Wechselwirkungen mit der Gesundheit und Ernährung des Wirts werden mittlerweile umfassend untersucht. Eine wichtige Rolle der menschlichen Darmmikrobiota ist der metabolische Abbau von komplexen Kohlenhydraten aus pflanzlichen und tierischen Quellen (z. B. Hülsenfrüchte, Samen, Gewebe und Knorpel). Kurzkettige Fettsäuren sind das Hauptprodukt der Kohlenhydratfermentation durch die intestinale Mikrobiota. Das Verständnis der Komplexität des Metabolismus komplexer Kohlenhydrate in der Darmmikrobiota stellt jedoch eine große Herausforderung dar.

In dieser Studie verwendeten die Forscher hybride metagenomische Assemblierung, um die Veränderungen in der Artenzusammensetzung der einzelnen Mikrobiota im Kontrollmodell-Darm für sechs strukturell unterschiedliche Kohlenhydrate zu bewerten. Größere N50-Werte und die längsten überlappenden Cluster wurden bei hybriden Assemblierungen im Vergleich zu Kurzleseassemblierungen gefunden. Fünfhundertneun hochwertige metagenomisch assemblierte Genome (MAGs), die 10 bakteriellen Klassen und 28 bakteriellen Familien angehören, wurden identifiziert. Bakterielle Arten, die Gene für Stärkebindungsmodule tragen, zeigten eine erhebliche Zunahme als Reaktion auf Stärke. Durch die Anwendung der hybriden Metagenomik können mehrere ungezüchtete Arten mit funktionalem Potenzial zur Abbau von Stärke-Substraten identifiziert werden, die für zukünftige Studien verwendet werden können.

Der phylogenetische Baum wurde aus verketteten Proteinsequenzen unter Verwendung von PhyloPhlAn erstellt und mit ggtree veranschaulicht (Ravi A u. a. 2022)

Zusammenfassung

Tiefe Lang- und Kurzlese-Metagenom-Sequenzierung sowie hybride Assemblierung haben großes Potenzial für das Studium der menschlichen Darmmikrobiota. Die hybride Assemblierung von Metagenomen führt nicht nur zu einer hohen Basisgenauigkeit, sondern auch zu einer um Größenordnungen verbesserten Splicing-Länge der Kurzlese-Sequenzierungsdaten, was die Assemblierung von Genomen ermöglicht, die näher an vollständig sind, einschließlich hochwertiger Genome, die Bakterienunterarten, seltene Mikroben, Plasmide und Phagen in komplexen Proben liefern können.

Referenzen:

1. Bertrand D, Shaw J, Kalathiyappan M, u. a. Hybride metagenomische Assemblierung ermöglicht eine hochauflösende Analyse von Resistenzdeterminanten und mobilen Elementen in menschlichen Mikrobiomen. Naturbiotechnologie, 2019, 37(8): 937-944.
2. Ravi A, Troncoso-Rey P, Ahn-Jarvis J, u. a. Hybride Metagenom-Assemblierungen verknüpfen die Kohlenhydratstruktur mit der Funktion im menschlichen Mikrobiom. Communications Biology 2022, 5(1): 1-13.