Wie man eine geeignete SNP-Genotypisierungs-Methode auswählt

SNPs sind ein integraler Bestandteil genetischer Studien, und SNP-Genotypisierung ist eine gängige Methode zur SNP-Erkennung. Es gibt viele etablierte SNP-Typisierungsverfahren, die jeweils ihre eigenen Eigenschaften und Anwendbarkeit haben.

Zu den gängigen Eingabemethoden gehören: Sanger-SequenzierungLigase-Erkennungsreaktion (LDR) Typisierung, Multiplex SNaPshot SNP-Genotypisierung, TaqMan SNP-Genotypisierung, MassArray SNP-Genotypisierung und PCR-RFLP-Typisierung usw., die Forschern vielfältige SNP-Typisierungslösungen bieten.

Wie wählt man also die richtige Testplattform für Ihr Experiment aus? Der Artikel beschreibt die technischen Eigenschaften jeder Typisierungs-methode und vergleicht sie, um Forschern zu helfen.

Sanger-Sequenzierung

Die Sanger-Sequenzierung basiert auf Dideoxynukleotid-Terminierungsreaktionen, um Fragmente unterschiedlicher Längen für die Sequenzierung zu erzeugen, und gilt als der "Goldstandard" für die SNP-Erkennung. Die Erkennungsrate der SNP-Erkennung durch Sanger-Sequenzierung liegt nahe bei 100 %.

Der Vorteil der Sanger-Sequenzierung besteht darin, dass die Ergebnisse genau sind, nicht nur um den Typ und die Lage von Mutationen zu bestimmen, sondern auch um unbekannte SNP-Loci zu entdecken.

Sein Nachteil ist jedoch die niedrige Durchsatzrate und die hohen Kosten. Daher ist das Sanger-Sequenzieren für Typisierungsprojekte mit wenigen Loci und wenigen Proben geeignet. Diese Typisierungstechnik ist sehr gut für Projekte geeignet, die extrem hohe Genauigkeitsanforderungen oder eine extrem kleine Probenanzahl (einige oder Dutzende) haben.

PCR-RFLP

PCR-RFLP ist die klassischste Forschungsmethode zur SNP-Typisierung. Ihr größter Vorteil ist, dass sie keine speziellen Instrumente erfordert, die Testdurchführung einfach und kostengünstig ist und sie auch für die Detektion von mittelgroßen Proben geeignet ist; der Nachteil ist, dass viele SNP-Loci mit dieser Methode nicht nachgewiesen werden können und einige Restriktionsenzyme teuer und nicht leicht verfügbar sind. Sie ist anfällig für falsch-positive Ergebnisse, erfordert viel Personal, dauert relativ lange und ist nicht für die Hochdurchsatzanalyse großer Proben geeignet. Dies ist eine frühe SNP-Typisierungstechnologie, die in Bezug auf Durchsatz und Effizienz schwer zu den Anforderungen der Batch-Typisierung zu erfüllen ist, weshalb diese Technologie weiterhin nur in einzelnen Laboren eingesetzt wird.

Ein Hauptnachteil von SNP-Arrays ist, dass sie unter Erfassungsbias leiden, d.h. sie können Marker-Eigenschafts-Assoziationen nicht identifizieren, wenn es sich um SNPs handelt, die in der Population, die für die Entwicklung des Arrays verwendet wurde, nicht vorhanden waren. Darüber hinaus besteht ein typisches Manko bei der Verwendung von SNP-Arrays darin, dass die Informationen (z.B. SNP-chromosomale Lage), die für das Design des Arrays verwendet werden, veraltet sein können und dass es keine Konsistenz in der Verwendung von SNPs zwischen verschiedenen Genotypisierungs-Array-Formaten gibt.

SNP-Genotypisierung durch PCR-RFLP und Sanger-Sequenzierung^[1]

Nächste Generation Sequenzierung (NGS)

Mit der Popularität der NGS-Technologie wird der Sequenzierungsdurchsatz erheblich erhöht und die Sequenzierungskosten sind im Vergleich zur Sanger-Sequenzierung deutlich gesenkt. Die NGS kann für SNP-Typisierung verwendet werden; nicht nur kann die Sequenzierleselänge die Typisierungsanforderungen erfüllen, sondern sie kann auch Hunderte von SNP-Loci gleichzeitig erfassen, und die Barcode-Primer können verschiedene Proben unterscheiden, was hochdurchsatzfähige Typisierungsexperimente mit mehreren Loci und großen Proben in einer Sequenzierung ermöglicht.

Im Vergleich zur Sanger-Sequenzierung behält diese Methode nicht nur die Vorteile der Sequenzierung bei, sondern kompensiert auch die Einschränkung der unzureichenden Durchsatzrate und reduziert erheblich den Bedarf an Probenvolumen. Die NGS-Typisierung wird ebenfalls schnell im Bereich gefördert.

RAD-Sequenz: Entdeckung und Genotypisierung von SNPs durch Next-Generation-Sequencing zur Genomkartierung^[2]

Ligase-Detektionsreaktion (LDR)

LDR verwendet eine Hochtemperatur-Ligase, um die Erkennung von Genpolymorphismus-Loci zu realisieren. Sobald die Hochtemperatur-Ligase erkennt, dass es eine Basenfehlpaarung bei einer genetischen Punktmutation an der Verbindung von DNA und zwei komplementären Oligonukleotiden gibt, kann die Ligation nicht fortgesetzt werden.

In dieser Methode werden zwei Sonden mit unterschiedlichen Längen gleichzeitig für das SNP-Lokus entworfen. Wenn die Enden der Sonde mit einer Base des Templates nicht gepaart sind, kann die Ligation nicht durchgeführt werden und es gibt kein Ligationprodukt; im Gegensatz dazu, wenn die Sonde vollständig komplementär zur Template-DNA ist, wird die Ligation durchgeführt, und diese spezifische Ligation kann wiederholt werden, um eine lineare Amplifikation zu erreichen. Schließlich wird die Detektion des SNP-Lokus durch das Scannen der Fragmentlänge mittels Fluoreszenz erreicht.

Der Vorteil der LDR-Ligase-Detektionsmethode besteht darin, dass sie auf jedes polymorphe Locus anwendbar ist, das Typisierungsergebnis genau ist, mehrere Reaktionen durchgeführt werden können, das Kosten-Nutzen-Verhältnis hoch ist und das Experiment flexibel ist. Im Vergleich zu der TaqMan Und Sanger-Sequenzierungsmethoden kann die LDR-Methode die gleichzeitige Detektion mehrerer Loci realisieren und die Detektionsdurchsatzrate verbessern, sodass es in der Anfangsphase eine gewisse Zeit in Anspruch nimmt, ein multiples Typisierungsschema aufzubauen. Diese Methode eignet sich sehr gut für dasselbe Typisierungsschema und die Typisierungsanforderungen kontinuierlicher Proben, was den experimentellen Durchsatz erhöhen und den Stückpreis der Typisierung senken kann.

SNaPshot

Diese Technologie, entwickelt von Applied Biotechnology (ABI), ist eine Typisierungstechnologie, die auf dem Prinzip der fluoreszenzmarkierten Einzelbasenverlängerung basiert und hauptsächlich auf mittel-hochdurchsatz SNP-Typisierungsprojekte abzielt. Das Reaktionssystem enthält Sequenzierungsenzyme, vier fluoreszenzmarkierte ddNTPs, Primer und PCR-Produktvorlagen, wobei die Primer nach einer Basenverlängerung terminiert werden. Nach der Detektion durch den ABI-Sequenzer wird das SNP-Lokus, das dem Verlängerungsprodukt entspricht, anhand des verschobenen Peaks bestimmt, und der Typ der eingebauten Base kann anhand der Farbe des Peaks erkannt werden, wodurch der Genotyp der Probe bestimmt wird. Die PCR-Produktvorlagen können durch mehrere PCR-Reaktionssysteme erhalten werden.

SNaPshot-Funktionen

(1) Genaues Tippen: Direkter Erhalt der Ergebnisse zur Basenzusammensetzungserkennung des Locus, die intuitiv und genau sind.

(2) Gleichzeitige Erkennung mehrerer Loci: Die Technologie zur gleichzeitigen Erkennung mehrerer Einzelbasen kann verwendet werden, um mehrere SNP-Loci in jeder Reaktion zu erkennen, während RFLP und TaqMan jeweils nur einen Locus gleichzeitig erkennen können.

(3) Nicht beschränkt auf die Art des SNP-Lokus-Polymorphismus: unabhängig davon, ob der Lokus heterozygot oder ein Insertion- oder Deletionspolymorphismus ist, kann er in einem System nachgewiesen werden.

(4) Kontaminierte Proben können erkannt werden: Wenn das Typing-Peakspektrum einer Probe von der normalen Verteilung abweicht, kann dies darauf hindeuten, dass die Probe kontaminiert ist oder die Konzentration zu niedrig ist, während andere Typing-Methoden dies nicht erkennen können. Es wird normalerweise für die Analyse von 10-30 SNP-Loci verwendet.

(5) Der TaqMan MGB-Sonden hat eine gute Fähigkeit, A/T-reiche Sequenzen zu identifizieren.

Aufgrund des hohen Preises von MGB-Sonden wird in der Regel die Taqman-Sondenmethode für die Analyse einer großen Anzahl von Proben mit einer kleinen Anzahl von SNP-Loci verwendet.

SNaPshot SNP-Genotypisierung^[3]

MassArray-Genotypisierung

Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation Zeitflug-Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS) ist das weltweit führende Werkzeug zur Genanalyse, das von Sequenom eingeführt wurde.

Durch die hohe Sensitivität der Massenspektrometrie ist es einfach, zwei Gensequenzen zu unterscheiden, die nur eine unterschiedliche Base enthalten, und SNP-Typisierung abzuleiten. Die iPLEX GOLD-Technologie, die auf der MassARRAY-Plattform basiert, ermöglicht das Design von bis zu 40-gewichtigen PCR-Reaktionen und die Genotypbestimmung, mit flexibler Versuchsplanung und hoher Genauigkeit der Typisierungsergebnisse. Bei der Untersuchung von Hunderten bis Tausenden von Proben für Dutzende bis Hunderte von SNP-Loci bietet MassARRAY das beste Preis-Leistungs-Verhältnis und ist besonders geeignet zur Validierung von Ergebnissen, die in genomweiten Studien gefunden wurden, oder wenn eine begrenzte Anzahl von Studienloci identifiziert wurde.

Vergleich von SNP-Genotypisierungsverfahren

Basierend auf der ausgezeichneten Synthese von allgemeinen Primern und fluoreszenzmarkierten Primern, Multiplex-PCR-Amplifikation und Sequenzierungstechnologien hat CD Genomics gestartet SNP-TypisierungsdiensteEs umfasst eine vollständige SNP-Typisierungsplattform von niedriger, mittlerer bis hoher Durchsatz, die den Anforderungen unterschiedlicher Projektgrößen gerecht werden kann und Ihnen maßgeschneiderte und personalisierte Dienstleistungen bietet.

Referenzen:

1. Rajkumar Sankaranarayanan u. a.Schützende Assoziation des A-T-T Haplotyps des DMT1-Gens gegen das Risiko von altersbedingtem nukleärem Katarakt beim Menschen, März 2019 Ophthalmologische Genetik 40(5):00-11
2. Nazarul Hasan u. a.Jüngste Fortschritte in der molekularen Marker-gestützten Selektion und deren Anwendungen in Pflanzenzüchtungsprogrammen. August 2021 Zeitschrift für Gentechnik und Biotechnologie 19(128)
3. Stéphanie Le Hellard u. a.SNP-Genotypisierung auf gepoolten DNAs: Vergleich von Genotypisierungstechnologien und einer halbautomatisierten Methode zur Datenspeicherung und -analyse September 2002 Nukleinsäuren Forschung 30(15):e74
4. Maria Svidnicki u. a.Screening genetischer Veränderungen im Zusammenhang mit nicht-syndromatischer Schwerhörigkeit unter Verwendung der MassARRAY iPLEX®-Technologie, September 2015 BMC Medizinische Genetik 16(1)