HLA-Typisierung durch Next-Generation-Sequenzierung-Protokoll

Benutzerdefinierte Oligo-Bibliotheksamplifikation und T7-Promotor-Zusatz

Benutzerdefinierte Oligo-Bibliotheksamplifikation (Optional)

1. Mischen Sie die folgenden Komponenten in einem sterilen, nukleasefreien Röhrchen.

2. Führen Sie eine PCR durch.

3. Vortexieren Sie die AMPure XP-Perlen zur Wiederaufhängung.
Fügen Sie 90 μL der resuspendierten Perlen zu den PCR-Reaktionen hinzu. Mischen Sie, indem Sie mindestens 15 Mal auf- und abpipettieren.
5. 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
6. Drehen Sie das Röhrchen schnell und platzieren Sie es auf einem magnetischen Ständer, um die Perlen von der Überstand zu trennen. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur, bis die Perlen vollständig aus der Lösung entfernt sind. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und entsorgen Sie ihn. Entsorgen Sie die Perlen nicht.
7. Fügen Sie 200 μL 70% Ethanol zur PCR-Platte hinzu, während sie sich im Magnetständer befindet. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 1 Minute und entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand und entsorgen Sie ihn.
8. Wiederhole den letzten Schritt noch einmal.
9. Lassen Sie die Perlen 5 Minuten an der Luft trocknen, während die PCR-Platte mit geöffnetem Deckel auf dem Magnetständer steht. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit
eine Pipette.
10. Entfernen Sie das Röhrchen vom Magneten. Eluieren Sie das DNA-Ziel von den Perlen in 42 μL Elutionspuffer (EB) oder 0,1× TE. Pipettieren Sie mindestens 15 Mal auf und ab. Drehen Sie das Röhrchen schnell und inkubieren Sie es bei Raumtemperatur für 2–3 Minuten.
11. Platzieren Sie die Probe auf einem geeigneten Magnetständer, um die Perlen vom Überstand zu trennen. Nachdem die Lösung klar ist, übertragen Sie vorsichtig 40 μL Überstand in ein neues PCR-Röhrchen. Proben können bei 2–8 °C für einige Tage oder bei −20 °C für die Langzeitlagerung aufbewahrt werden.
12. Überprüfen Sie die Größe des Produkts.

T7-Promotor-Zusatz

1. Mischen Sie die Komponenten aus Tabelle 3 in einem sterilen, nukleasefreien Röhrchen.
2. Führen Sie eine PCR durch.
3. Um das PCR-Produkt zu reinigen und eine Größenauswahl durchzuführen, die AMPure XP-Perlen vortexen, um sie wieder in Lösung zu bringen.
Fügen Sie 50 μL (1×) resuspendierte AMPure XP-Perlen zu 50 μL DNA-Lösung hinzu. Gut mischen, indem Sie vortexen oder mindestens 20 Mal auf- und abpipettieren.
5. 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
6. Stellen Sie das Röhrchen auf einen Magnetständer, um die Perlen vom Überstand zu trennen. Nachdem die Lösung klar ist, übertragen Sie den Überstand vorsichtig in ein neues Röhrchen und entsorgen Sie den Überstand nicht.
Fügen Sie 30 μL (0,6×) resuspendierte AMPure XP-Perlen zur Überstand hinzu, mischen Sie gut und inkubieren Sie 5 Minuten bei Raumtemperatur.
8. Stellen Sie das Röhrchen auf einen Magnetständer, um die Perlen vom Überstand zu trennen. Nachdem die Lösung klar ist, entfernen Sie vorsichtig den Überstand und entsorgen Sie ihn. Achten Sie darauf, die Perlen, die die DNA-Ziele enthalten, nicht zu stören.

Fügen Sie 200 μL 80% frisch zubereitetem Ethanol zu dem Röhrchen hinzu, während es im Magnetständer steht. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 30 Sekunden und entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand und entsorgen Sie ihn.
10. Wiederholen Sie Schritt 9 einmal.
11. Lassen Sie die Perlen bei aufrechter Position auf dem Magnetrack 5 Minuten an der Luft trocknen.
12. Entfernen Sie das Rohr vom Magneten. Eluieren Sie das DNA-Ziel von den Perlen in 32 μL Elutionspuffer (EB) oder 0,1× TE. Gut mischen auf
ein Vortexmischer oder durch Pipettieren nach oben und unten, 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
13. Stellen Sie das Röhrchen in ein magnetisches Rack, bis die Lösung klar ist, etwa 3 Minuten. Übertragen Sie etwa 30 μL des Überstands in ein sauberes Röhrchen. Proben können bei 2–8 °C für einige Tage oder bei −20 °C für die Langzeitlagerung aufbewahrt werden.
14. Überprüfen Sie die Größe des Produkts.

RNA-Bait-Synthese aus DNA-Vorlage (Biotin-UTP-Transkription)

1. Tauchen Sie die Kit-Komponenten auf, mischen Sie sie und zentrifugieren Sie sie kurz in einem Mikrozentrifugenröhrchen, um die Lösungen am Boden der Röhrchen zu sammeln. Auf Eis halten.
2. Stelle die Reaktion zusammen.
3. Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 °C über Nacht für 14 Stunden.
Zu 20 μL Reaktion fügen Sie 70 μL nukleasefreies Wasser, 10 μL von 10× Reaktionspuffer und 2 μL RNase-freie TURBO TM DNase hinzu, mischen und inkubieren Sie bei 37 °C für 15 Minuten.
5. Reinigen Sie die RNA-Baits mit dem Qiagen RNeasy MinElute Cleanup Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers. Teilen Sie das Reaktionsvolumen auf und verwenden Sie 50 μL pro Säule. Eluieren Sie zweimal in 15 μL und 10 μL steriler, nukleasefreier Lösung. Das gesamte Elutionsvolumen beträgt 25 μL.
6. Fügen Sie 1 μL RNase-Inhibitor zu den eluierten RNA-Baits hinzu.
7. Überprüfen Sie die Größenverteilung und Konzentration.
8. Passen Sie die Konzentration der Baits auf 100 ng/μL mit sehr reinem, nukleasefreiem Wasser an (verwenden Sie ein separates Röhrchen mit nukleasefreiem Wasser nur für diesen Zweck). Die Konzentration von 100 ng/μL wird als Stammlösung der HLA-RNA-Baits betrachtet.

Qualitätskontrolle der RNA-Bait-Bibliothek

Reverse Transkription (cDNA-Synthese)

1. Mischen Sie jede Komponente des Kits kurz und zentrifugieren Sie sie vor der Verwendung und kombinieren Sie die Komponenten in einem 0,2 mL Röhrchen.

2. Inkubieren Sie das Röhrchen bei 65 °C für 5 Minuten und stellen Sie es dann für mindestens 1 Minute auf Eis.
3. Bereiten Sie das cDNA-Synthesemix vor.

Fügen Sie 10 μL cDNA-Synthesemischung zu der RNA-Bait/Primer-Mischung hinzu, mischen Sie vorsichtig und sammeln Sie durch kurze Zentrifugation.
5. Sammeln Sie die Reaktion durch kurze Zentrifugation. Fügen Sie 1 μL RNase H zu jedem Röhrchen hinzu und inkubieren Sie die Röhrchen 20 Minuten bei 37 °C. Die cDNA-Synthesereaktion kann bei −20 °C für die Langzeitlagerung aufbewahrt oder sofort für qPCR verwendet werden.

SYBR Green qPCR

Mischen Sie die Komponenten in der sterilen optischen 96-Well-Platte für die Echtzeit-PCR.

2. Führen Sie die Reaktionen durch.

3. Wenn die Synthese der RNA-Baits erfolgreich war, sollten die CT-Werte zwischen 10 und 15 Zyklen liegen. NC sollte überhaupt nicht erscheinen oder erst nach mehr als 30 Zyklen.

Bibliotheksvorbereitung

gDNA Fragmentierung

1. Um die NEBNext End Prep durchzuführen, mischen Sie die Komponenten in einem sterilen, nukleasefreien Röhrchen.

2. Mischen durch Pipettieren, gefolgt von einem kurzen Zentrifugieren, um die gesamte Flüssigkeit von den Seiten des Röhrchens zu sammeln.
3. Stellen Sie es in einen Thermocycler mit beheiztem Deckel und starten Sie das Programm.

4. Mischen durch Pipettieren, gefolgt von einem kurzen Zentrifugieren, um die gesamte Flüssigkeit von den Seiten des Röhrchens zu sammeln.
5. Inkubieren Sie 15 Minuten bei 20 °C in einem Thermocycler.
6. Fügen Sie 3 μL Enzym zur Ligation Mischung aus dem vorherigen Schritt hinzu.
7. Gut mischen und 15 Minuten bei 37 °C inkubieren.
8. Reinigung von Adapter-ligiertem DNA.
Fügen Sie 86,5 μL resuspendierte AMPure XP-Perlen zur Ligationreaktion hinzu. Mischen Sie gut, indem Sie mindestens 10 Mal auf- und abpipettieren.
10. 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
11. Drehen Sie das Röhrchen schnell und stellen Sie es auf einen geeigneten Magnetständer, um die Perlen von der Überstandflüssigkeit zu trennen. Nachdem die Lösung klar ist (nach etwa 5 Minuten), entfernen Sie vorsichtig den Überstand und entsorgen Sie ihn. Achten Sie darauf, die Perlen, die die DNA-Ziele enthalten, nicht zu stören.
12. Fügen Sie 200 μL 80% frisch zubereitetem Ethanol zu dem Röhrchen hinzu, während es sich im Magnetständer befindet. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 30 Sekunden und entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand und entsorgen Sie ihn.
13. Wiederholen Sie Schritt 12 einmal.
14. Lassen Sie die Perlen 5 Minuten an der Luft trocknen, während das Röhrchen auf dem Magnetständer steht und der Deckel offen ist.
15. Entfernen Sie das Röhrchen/die Platte vom Magneten. Eluieren Sie das DNA-Ziel von den Perlen, indem Sie 17 μL von 10 mM Tris-HCl oder 0,1× TE hinzufügen.
16. Gut durch Pipettieren nach oben und unten oder auf einem Vortex-Mischer mischen. 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
17. Drehen Sie das Röhrchen schnell und stellen Sie es auf den Magnetständer.
18. Nachdem die Lösung klar ist (nach etwa 5 Minuten), übertragen Sie 15 μL in ein neues PCR-Röhrchen zur Amplifikation.
19. Mischen Sie die Komponenten in sterilen Streifenröhrchen, um die PCR-Amplifikation einschließlich der Indizierung zu starten. Führen Sie das PCR-Programm aus.
20. Fügen Sie 45 μL der resuspendierten AMPure XP-Perlen zu den PCR-Reaktionen (~50 μL) hinzu. Mischen Sie gut, indem Sie mindestens 10 Mal auf- und abpipettieren.
21. 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
22. Drehen Sie das Röhrchen schnell und stellen Sie es auf einen geeigneten Magnetständer, um die Perlen von der Überstandflüssigkeit zu trennen. Nachdem die Lösung klar ist (nach etwa 5 Minuten), entfernen Sie vorsichtig den Überstand und entsorgen Sie ihn. Achten Sie darauf, die Perlen, die die DNA-Ziele enthalten, nicht zu stören.
23. Fügen Sie 200 μL 80% Ethanol zur PCR-Platte hinzu, während sie sich im Magnetständer befindet. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 30 Sekunden und entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand und entsorgen Sie ihn.
24. Lassen Sie die Perlen 5 Minuten an der Luft trocknen, während die PCR-Platte mit offenem Deckel auf dem Magnetständer steht.
25. Entfernen Sie das Röhrchen/die Platte vom Magneten. Eluieren Sie das DNA-Ziel von den Perlen in 33 μL 0,1× TE. Mischen Sie gut, indem Sie mindestens 10 Mal auf- und abpipettieren. Drehen Sie das Röhrchen schnell und inkubieren Sie es 2 Minuten bei Raumtemperatur.
26. Platzieren Sie die Probe auf einem geeigneten Magnetständer, um die Perlen vom Überstand zu trennen. Nachdem die Lösung klar ist (ca. 5 Minuten), übertragen Sie vorsichtig 28 μL Überstand in ein neues PCR-Röhrchen. Bibliotheken können bei −20 °C aufbewahrt werden.
27. Überprüfen Sie die Größenverteilung mit einem Aliquot der Bibliothek.

Gezielte Anreicherung (Bait-basiert)

Hybridisierung

1. Für die Singleplex-Hybridisierung (500 ng DNA-Eingang) die HLA-RNA-Bait-Lösung (100 ng/μL) 1:5 mit nukleasefreiem Wasser verdünnen.
2. Für Multiplex-Hybridisierung:
(a) 8 Proben (jeweils 62,5 ng DNA-Eingang), die HLA-RNA-Bait-Stocklösung 1:5 mit nukleasefreiem Wasser verdünnen.
(b) 6 Proben (jeweils 31,25 ng DNA-Eingang), HLA-RNA-Bait-Lösung 1:5 mit nukleasefreiem Wasser verdünnen.
3. Richten Sie das Programm auf einem Thermocycler ein. Dieses Programm hilft während des Vorwärmens der Komponenten und führt schließlich die Inkubation bei 65 °C für die Hybridisierung durch.
4. Bereiten Sie das Bibliotheksgemisch in einem nukleasefreien Röhrchen vor und vortexen Sie es.
Bereiten Sie die Hybridisierungsmixtur in einem nukleasefreien Rohr vor und vortexen Sie.
6. Bereiten Sie die Fangmischung in einem nucleasefreien Röhrchen vor und vortexen Sie.
7. Platzieren Sie das Bibliotheksmix in einem Thermocycler. Sobald Schritt 2 des Zyklus erreicht ist, legen Sie das Röhrchen mit dem Hybridisierungs-Mix in den Zyklierer, um das Vorwärmen durchzuführen. Wenn Schritt 3 des Zyklierers erreicht ist, fügen Sie das Röhrchen mit dem Fangmix zum Thermocycler hinzu, um auch dieses Element vorzuwärmen. Schritt 4 des Zyklierers stellt die Hybridisierung dar. Wenn dieser Schritt erreicht ist, fügen Sie 7 μL des vorgewärmten Bibliotheksmix und 13 μL des vorgewärmten Hybridisierungs-Mix zum vorgewärmten Fangmix hinzu. Mischen Sie durch sanftes Pipettieren.
8. Inkubieren Sie die Hybridisierungsreaktion bei 65 °C für 36 Stunden.

Wiederherstellung von Bait-DNA-Hybriden

Übertragen Sie 50 μL magnetischer Perlen in ein neues 1,5 mL Röhrchen.
2. Pelletperlen mit einem magnetischen Partikelstand zentrifugieren und das Überstand entsorgen.
3. Fügen Sie 200 μL Bindepuffer zu den Perlen hinzu, um sie zu waschen. Vortexen Sie das Röhrchen 5–10 Sekunden, stellen Sie es für 2 Minuten auf einen Magnetpartikelständer, um die Perlen zu pelletieren, und entfernen Sie die Überstände und entsorgen Sie sie.
4. Suspendieren Sie die Perlen in 200 μL Bindepuffer.
6. Übertragen Sie die Hybridisierungslösung in den Bindepuffer/ die Perlen und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie die Perlen mit einem magnetischen Partikelständer für 2 Minuten und entfernen Sie die Überstände.
7. Fügen Sie 500 μL Waschpuffer 1 zu den Perlen hinzu und vortexen Sie kurz, um sie wieder in Suspension zu bringen. Inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur. Pelletieren Sie die Perlen mit einem Magnetpartikelständer für 2 Minuten und entfernen Sie den Überstand.
8. Fügen Sie 500 μL Waschpuffer 2 bei 65 °C zu den Perlen hinzu und vortexen Sie kurz, um zu mischen. Inkubieren Sie 10 Minuten bei 65 °C. Pelletieren Sie die Perlen mit einem magnetischen Partikelständer für 2 Minuten und entfernen Sie den Überstand.
Wiederholen Sie Schritt 8 zweimal für insgesamt drei 65 °C-Wäschen. Stellen Sie sicher, dass alle zusätzlichen Puffer entfernt wird.

Elution von Ziel-DNA

Fügen Sie 50 μL frisch zubereitetes Elutionspuffer zu den Perlen hinzu.
2. Vortex für 5–10 s, um zu mischen.
3. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
4. Pelletieren Sie die Perlen und übertragen Sie den Überstand in ein Röhrchen mit 70 μL Neutralisationspuffer.

AMPure XP Perlenreinigung

Fügen Sie 120 μL AMPure XP-Perlen hinzu und inkubieren Sie 5 Minuten bei Raumtemperatur.
2. 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
3. Drehen Sie das Röhrchen schnell und platzieren Sie es auf einem geeigneten Magnetständer, um die Perlen von der Überstandflüssigkeit zu trennen. Nachdem die Lösung klar ist, entfernen Sie vorsichtig den Überstand und entsorgen Sie ihn. Achten Sie darauf, die Perlen, die die DNA-Ziele enthalten, nicht zu stören.
Fügen Sie 200 μL 80% Ethanol hinzu, während das Röhrchen im Magnetständer ist. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 30 Sekunden und entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand und entsorgen Sie ihn.
5. 5 Minuten bei Raumtemperatur trocknen.
6. Entfernen Sie das Röhrchen vom Magneten. Fügen Sie 30 μL 0,1× TE hinzu. Mischen Sie gut, indem Sie mindestens 10 Mal auf- und abpipettieren. Drehen Sie das Röhrchen schnell und inkubieren Sie es 2 Minuten bei Raumtemperatur.
7. Platzieren Sie die Probe auf einem geeigneten Magnetständer, um die Perlen vom Überstand zu trennen. Nachdem die Lösung klar ist, übertragen Sie vorsichtig 28 μL des Überstands in ein neues PCR-Röhrchen.

Amplifikation des angereicherten Ziels

1. Bereiten Sie den PCR-Mix auf Eis in einem nukleasefreien Röhrchen vor und mischen Sie ihn durch Pipettieren.
2. Platzieren Sie die Röhrchen in einem Thermocycler und führen Sie das Programm aus.
3. Reinigen Sie die DNA mit AMPure XP-Perlen.
4. Validieren und quantifizieren Sie ein Aliquot der angereicherten Bibliothek.

NGS-Sequenzierung einer angereicherten Bibliothek

1. Laden Sie den HiSeq2500 mit der angereicherten Bibliothek und führen Sie eine Paar-End-Sequenzierung mit dem HiSeq® SBS Kit v4 (250 Zyklen) durch.
2. Stellen Sie die demultiplexierten Fastq-Dateien aus dem Sequenzierungslauf für die Datenanalyse zur Verfügung.

Referenz:

1. Wittig M, Juzenas S, Vollstedt M, u. a.Hochauflösende HLA-Typisierung durch Next-Generation-Sequenzierung von zufällig fragmentierter Ziel-DNA[M]//HLA-Typisierung. Humana Press, New York, NY, 2018: 63-88.