Dual-RNA-Sequenzierung: Definition & Prinzip, Arbeitsablauf und Anwendungen

Was ist dual RNA-Sequenzierung?

Das Verständnis, wie Krankheitserreger Krankheiten hervorrufen, erfordert Kenntnisse darüber, welche Gene exprimiert werden und wie sie während einer Infektion reguliert sind. Die RNA-Sequenzierung wird routinemäßig verwendet, um die Genexpression von mikrobiellen Krankheitserregern zu analysieren. Neben der standardmäßigen mRNA-Sequenzierung entstehen neue Methoden, die auf RNA-seq basieren und die posttranskriptionalen Netzwerke kartieren, die von kleinen RNAs kontrolliert werden, sowie die damit verbundenen RNA-bindenden Proteine im Krankheitserreger selbst zu entdecken. Die Dual-RNA-Sequenzierung ist eine der neuartigen RNA-seq-Technologien. Sie beleuchtet die gleichzeitige Transkriptomik in Wirt-Krankheitserreger-Interaktionen und eignet sich besonders gut zur Untersuchung der molekularen Mechanismen der Interaktionen zwischen Wirten und Krankheitserregern. Die Dual-RNA-Sequenzierung erfordert keine vorab entworfenen artspezifischen Sonden und ermöglicht die empfindliche Detektion von Transkripten mit niedrigen Abundanzen. Darüber hinaus ermöglicht sie die Analyse spezifischer Transkripte für Krankheitserreger und Wirt in Mischproben von mindestens zwei Arten und offenbart die Rolle von nicht-kodierender RNA im Infektionsprozess. Auch die Korrelation zwischen der mikrobiellen Genaktivität und spezifischen Wirtreaktionen kann geklärt werden. Die Dual-RNA-Sequenzierung kann die Studien in verschiedenen Bereichen, einschließlich Pathologie und Krankheitsbehandlung, erleichtern. 

Der Arbeitsablauf der dualen RNA-Sequenzierung

Dual-RNA-Seq Die parallele transkriptomische Analyse von bakteriellen Pathogenen und ihren eukaryotischen Wirtzellen umfasst in der Regel einen typischen Workflow, der RNA-Extraktion, rRNA-Depletion, Bibliotheksvorbereitung, Sequenzierung sowie Datenanalysen und -interpretation beinhaltet. Die Datenanalyseverfahren umfassen dabei die Vorverarbeitung, Ausrichtung und weitere fortgeschrittene nachgelagerte Analysen wie alternative und nicht-lineare Spleißung, differentiellen Ausdruck und epigenetische Analysen, die schließlich ein Ergebnis liefern, das Qualitätsberichte, Berechnungen und Vorhersagen für neuartige Transkripte, Wahrscheinlichkeiten für differentiell exprimierte Transkripte und Transkriptcharakterisierungen umfasst.

Ähnlich wie bei konventionellen transkriptomischen Methoden umfasst das duale RNA-seq die Quantifizierung, das Screening von Unterschieden, die Pfadannotierung, den Netzwerkaufbau und so weiter. In Bezug auf den früheren Teil des Prozesses wird das entsprechende Referenzgenom für die folgenden bioinformatischen Analysen benötigt.

Anwendungen

Dual RNA-Seq untersucht die Wechselwirkungen zwischen Krankheitserregern und ihren Wirten, wobei totale RNA aus infizierten Zellen extrahiert wird. Die Sequenzierung und Analyse der interessierenden RNAs von bakteriellen Krankheitserregern und infizierten Zellen kann gleichzeitig erfolgen, während die gemischten Sequenzierungsreads ihren ursprünglichen Genomen zugeordnet werden. Dual RNA-Seq basiert auf der Verbesserung der Bibliothekskonstruktion und Sequenzierungstechnologie. Es kann die Forschung in mehrere Richtungen erleichtern, einschließlich, aber nicht beschränkt auf:

• Variationen der Genexpressionsniveaus von Wirt und Pathogen
• Studium von infektionsbezogenem sRNA, mitochondrialer RNA, usw.
• Umfassende Studie über signalpfadbezogene nicht-kodierende RNA
• Untersuchung der Unterschiede zwischen wilden und mutierten Krankheitserregern mittels vergleichender Genomik
• Aufdeckung des Interaktionsmechanismus zwischen Arten durch Untersuchung der Genregulationsbeziehungen
• Studie des regulatorischen Netzwerks, des pathogenen Mechanismus während der Infektion und des Wirtsresistenzmechanismus im Prozess der Pathogen-Wirt-Interaktion.
• Studying der evolutionären Beziehungen zwischen Pathogenen verschiedener Arten und weitere Entdeckungen positiver Selektion basierend auf homologen Genen.

Referenzen:

1. Westermann A; u. a. Lösung von Wirt-Pathogen-Interaktionen durch duales RNA-Sequencing. PLOS Pathogene2017, 13.
2. Marsh JW; u. a. Eine Labor-Methode für die duale RNA-Sequenzierung von Bakterien und ihren Wirtszellen in vitro. Grenzen in der Mikrobiologie2017, 8.