Annotation von regulatorischen Elementen im Zebrafisch-Genom

In den letzten zwei Jahrzehnten hat sich die Zebrafisch als ein weit verbreitetes Modellorganismus etabliert, dank ihrer schnellen embryonalen Entwicklung und der transparenten Natur ihrer extern befruchteten Embryonen, was sie außergewöhnlich geeignet für die Entwicklungsforschung macht. Ihre Kompatibilität mit sowohl vorwärts- als auch rückwärtsgerichteten genetischen Ansätzen hat die Entdeckung von Genen und die Modellierung menschlicher Krankheiten erheblich erleichtert. Im Jahr 2013 gelang es dem Sanger-Institut, das Genom des Zebrafischs zu sequenzieren, das eine riesige Fläche von 1,5 Millionen Quadratmetern umfasst. Das Zebrafisch-Genom, das ungefähr 1,4 Gb umfasst und mindestens 25.000 Gene kodiert, ist in seiner Größe mit den Genomen anderer Wirbeltiere vergleichbar. Interessanterweise zeigen mehr als 70 % der menschlichen Gene Homologie zu ihren Zebrafisch-Gegenstücken. Das Zebrafisch-Genom stellt jedoch eine bemerkenswerte Herausforderung dar, die dem menschlichen Genom ähnlich ist, hauptsächlich in Form von nicht-kodierenden Annotationen.

Diese Forschung implementierte eine Methodik, die anderen kollaborativen Projekten wie ENCODE ähnelt. Durch die Nutzung dieser Strategie überprüften die Forscher eine erhebliche Menge an zuvor veröffentlichten Datensätzen, die fast 1.500 umfassten, und führten zusätzlich über 350 neue Datensätze ein. Diese Datensätze umfassten verschiedene Hochdurchsatztechniken, einschließlich ChIP-seq zur Profilerstellung von Chromatinmodifikationen, die mit Promotoren und Enhancern assoziiert sind. ATAC-seq zur Identifizierung zugänglicher Regionen im Genom, RNA-Seq Für den Aufbau von Genmodellen wurden die Cap-Analyse der Genexpression (CAGE) zur Bestimmung der 5'-transkriptionalen Endpunkte sowie Hi-C oder 4C-seq zur Aufdeckung intrachromosomaler Interaktionen eingesetzt. Bemerkenswert ist, dass diese umfangreiche Sammlung von Datensätzen 15 verschiedene Entwicklungsstadien sowie adulte Gewebe umfasste, was eine dynamische Bewertung genomischer Veränderungen während der Embryogenese ermöglichte. Die Ergebnisse dieser Studie sind leicht zugänglich und können über den UCSC Genome Browser erkundet werden.

Umfassende Sammlung und Annotation von genomischen Daten zur Entwicklung von Zebrafischen. (Baranasic) u. a.., 2022)

Die Autoren nutzten ihren Datensatz, um nicht-kodierende Elemente im Zebrafischgenom sorgfältig zu annotieren, wobei der Schwerpunkt auf Promotoren und Enhancern lag. Um Promotorregionen zu identifizieren, begannen sie den Prozess mit der Verwendung von RNA-Seq Daten zur Identifizierung von Genmodellen. Anschließend integrierten sie CAGE-Reads, die speziell das 5'-Ende von Transkripten erfassen und mit der Promotorregion übereinstimmen. Dieser sorgfältige Ansatz führte zur genauen Bestimmung der Transkriptionsstartstellen.

Es ist wichtig zu beachten, dass der Datensatz verschiedene embryonale Stadien umfasst und somit eine komplexe zeitliche Perspektive darauf bietet, wie Promotoren sich während der Entwicklung entwickeln. Um die Genauigkeit dieses "Promotor-Sets" zu validieren, verwendeten die Autoren dCas9, ein Enzym, das dazu entwickelt wurde, Cas9 zu deaktivieren, wodurch die Bindung von Transkriptionsaktivatoren an Promotoren verhindert und somit die Genexpression an ausgewählten Promotorstandorten reduziert wird. Bemerkenswerterweise führte die gezielte Anwendung von dCas9 auf die Transkriptionsstartstellen, die durch CAGE-Daten definiert sind, zu einer stärkeren Genrepression im Vergleich zu Standorten, die durch Ensembl-Anmerkungen definiert sind, was die überlegene Genauigkeit ersterer bei der Identifizierung aktiver Promotoren unterstreicht. Diese unschätzbare Ressource bietet Forschern eine solide Grundlage für die Durchführung von Knockout-Studien.

In ihrem Bestreben, die Charakterisierung von Promotoren vertiefend zu untersuchen, beschäftigten sich die Autoren mit Chromatinmodifikationen, der Zugänglichkeit über die Entwicklungszeit hinweg und der Bewertung der Sequenzkonservierung. Diese umfassenden Analysen enthüllten eine Vielzahl einzigartiger Promotorstrukturen, die durch dynamische Aktivierungsmuster während der embryonalen Entwicklung gekennzeichnet sind. Während die biologische Bedeutung dieser unterschiedlichen Aktivierungsmuster ein Rätsel bleibt, stellen sie einen vielversprechenden Ausgangspunkt für zukünftige hypothesengeleitete Experimente und Untersuchungen dar.

Transkriptkategorien und Einzel-Nukleotid-Resolution zur Verifizierung des 5′-Endes während der Entwicklung. (Baranasic) u. a.., 2022)

Diese Studie bietet auch eine erste Annotation aktiver Enhancer im Zebrafischgenom, die durch die Integration von Zugänglichkeit und Mustern der Chromatinmodifikation erreicht wurde. Ihre umfassende Analyse führte zur Identifizierung von mehr als 100.000 Elementen, die eine vorhergesagte Enhancer-Aktivität aufweisen. Diese Elemente können weiter basierend auf ihren dynamischen Aktivierungsmustern in verschiedenen Entwicklungsstadien klassifiziert werden. Um die Funktionalität dieser Enhancer zu bestätigen, bewerteten die Forscher sie durch die Co-Expression von nuklearen Käfig-Enhancer-RNAs und verglichen ihre Ergebnisse mit zuvor veröffentlichten Berichten.

Anschließend nutzten die Autoren verfügbare Einzelzell-ATAC-seq Daten zur Erstellung prädiktiver Bewertungen der zellspezifischen Aktivität von etwa 40.000 Enhancern. Viele dieser Vorhersagen fanden Unterstützung in veröffentlichten Reporteranalysen. Die Studie vertiefte sich weiter in die Interaktionen zwischen Enhancern und Promotoren, indem sie Daten aus intrachromosomalen Interaktionen unter Verwendung von Hi-C- und 4C-seq-Datensätzen integrierte. Diese Analyse offenbarte eine ausgeprägte genomische Signatur, die als H3K27ac-Sequenz bezeichnet wird und gemeinsame Merkmale mit Super-Enhancern aufweist. Interessanterweise erschien der H3K27ac-Gencluster breiter und zahlreicher als Super-Enhancer und war mit der Expression von frühen Entwicklungsgenen vor der Linien-Spezifizierung verbunden.

Von bemerkenswerter Bedeutung führten die Autoren einen innovativen Ansatz ein, um die Genome von entfernt verwandten Arten zu vergleichen. Dieser Ansatz ermöglichte es ihnen, co-lineare regulatorische Elemente zu identifizieren, die zwischen Maus und Zebrafisch geteilt werden, was das potenzielle Vorkommen der H3K27ac-Sequenz in der Regulierung des Wirbeltiergenoms unterstreicht. Infolgedessen hat die umfassende Annotation des Zebrafischgenoms, die von der DANIO-CODE-Initiative durchgeführt wurde, das Potenzial, die Identifizierung einzigartiger, konservierter und entwicklungsrelevanter genomischer regulatorischer Merkmale zu erleichtern.

Klassifizierung von entwicklungsbezogenen cis-regulatorischen Elementen. (Baranasic) u. a.., 2022)

Zebrafische, die als Modellorganismus für Entwicklungsstudien bekannt sind, haben sich als äußerst wertvoll bei der Erforschung funktioneller nicht-kodierender Sequenzen erwiesen, die sowohl für die transkriptionale als auch für die post-transkriptionale Regulation entscheidend sind. In Erwartung der nächsten Forschungsphasen wird erwartet, dass wir tiefer in die funktionale Charakterisierung der in unseren ersten Analysen identifizierten Elemente eintauchen. Dies könnte beispielsweise Reporterassays umfassen, die leicht und schnell in lebenden Zebrafischembryos durchgeführt werden können.

Darüber hinaus ist die Einbeziehung von Einzelzell-Molekulartechniken entscheidend, um unser Verständnis zu verfeinern. Die vorläufigen DANIO-CODE-Untersuchungen stützten sich überwiegend auf ganze Embryonen, was potenzielle Komplikationen bei der Interpretation der aktuellen Ergebnisse mit sich brachte. Angesichts der Knappheit von Zebrafischzelllinien wird der Fortschritt der Technologie in der molekularen Analyse auf Einzelzellebene und deren anschließende Anwendung auf Zebrafischembryonen in den kommenden Phasen von DANIO-CODE von entscheidender Bedeutung sein.

Referenz:

1. Baranasic, Damir, et al. "Multiomischer Atlas mit funktioneller Stratifikation und Entwicklungsdynamik von Zebrafisch-Cis-regulatorischen Elementen." Naturgenetik 54,7 (2022): 1037-1050.