Fortschritte bei der Pathogenerkennung im Zusammenhang mit neonatalen Todesfällen durch metagenomische Sequenzierung

Laut Umfragedaten der Weltgesundheitsorganisation verloren im Jahr 2021 weltweit etwa 5 Millionen Kinder tragischerweise ihr Leben, bevor sie das Alter von 5 Jahren erreichten. Schockierenderweise ereigneten sich 46 % dieser herzzerreißenden Todesfälle im ersten Lebensmonat, während des sogenannten Neugeborenenzeitraums. Traditionell basierten Modelle zur Bestimmung der Todesursachen bei Kindern stark auf der Ableitung von Schlussfolgerungen über die Todesursache und der Analyse von Sterberegisterdaten. Diese Methoden führen jedoch oft dazu, dass Todesfälle einer einzigen zugrunde liegenden Krankheit zugeschrieben werden, was es äußerst schwierig macht, die wahre Ursache für diese herzzerreißenden Verluste zu ermitteln.

In den letzten Jahren gab es einen vielversprechenden Durchbruch im Verständnis der Todesursachen bei Kindern durch eine Technik, die als postmortale minimal-invasive Gewebeentnahme (MITS) bekannt ist. Durch die Kombination von MITS mit anderen wertvollen Informationen können wir nun tiefer in die Charakterisierung der Ursachen von neonatalem Tod eintauchen. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, nicht nur die unmittelbaren Ereignisse, die zum Tod führen, sondern auch die Vorbedingungen und zugrunde liegenden Ursachen zu identifizieren, die letztendlich zu diesen tragischen Ergebnissen führen.

Metagenomische Next-Generation Sequenzierung (mNGS)

Derzeit haben sich herkömmliche Tests, wie traditionelle Kulturmethoden und Nukleinsäure-Amplifikationstests, als unzureichend erwiesen, wenn es darum geht, Pathogene zu erkennen, die für infektiöse Todesfälle bei Kindern verantwortlich sind. Betreten Sie die Next-Generation-Metagenom-Sequenzierung (mNGS), das bereit ist, diese Herausforderungen anzugehen. Im Gegensatz zu seinen Vorgängern basiert mNGS nicht auf vorab ausgewählten Zielen und hat die bemerkenswerte Fähigkeit, Viren, Bakterien und Pilze ohne inhärente Voreingenommenheit zu identifizieren. Dieser Fortschritt verspricht ein differenzierteres Verständnis der Rolle, die verschiedene Erreger im komplexen Geflecht der Ursachen für den Tod spielen. Darüber hinaus ermöglicht uns mNGS, die antimikrobielle Arzneimittelresistenz zu analysieren, ohne auf kulturbasierte Methoden angewiesen zu sein, wodurch wir antimikrobielle Resistenzgene in Proben identifizieren können.

In dieser Forschung bewertete das Team die Wirksamkeit von mNGS bei der Identifizierung von Krankheitserregern, die mit neonatalen Todesfällen in Verbindung stehen. Dies geschah durch die Untersuchung von Blut- und Lungengewebeproben, die durch MITS von postmortalen Neugeborenen in Soweto, Südafrika, entnommen wurden. Erstaunlicherweise stimmten die Ergebnisse der mNGS in erstaunlichen 90 % der Fälle mit denen überein, die durch traditionelle Kulturmethoden und Nukleinsäure-Amplifikationstests (NAAT) erzielt wurden, und identifizierten die für diese tragischen Verluste verantwortlichen Krankheitserreger. Darüber hinaus lieferte mNGS wichtige Einblicke in die Resistenzprofile dieser Krankheitserreger und deckte viele multiresistente Bakterien auf.

Metagenomische NGS-Analyse enthüllt Krankheitserreger und Gene für antimikrobielle Resistenzen bei neonatalen Infektionen

Das Forschungsteam führte eine Studie mit 236 geeigneten Neugeborenen durch, die leider verstorben sind. Sie führten eine minimal-invasive Gewebeentnahme (MITS) an 153 dieser Neugeborenen durch. Die potenziellen Todesursachen (CoDs) waren vielfältig, wobei die Mehrheit (53%) auf Komplikationen aufgrund einer Frühgeburt zurückzuführen war, während 15% mit Ereignissen während der Geburt in Verbindung standen und 13% auf angeborene Anomalien zurückzuführen waren. Bemerkenswert ist, dass 88 Fälle mit bestätigten oder potenziellen Ursachen von Infektionskrankheiten assoziiert waren.

Unter den nicht-infektiösen krankheitsbedingten Todesfällen wurden 16 Fälle als Kontrollen einbezogen. Unter den Patienten, die an Infektionen verstorben sind, hatten 31 verfügbares Restlungengewebe und Blutproben für metagenomische Next-Generation-Sequenzierung (mNGS) In 20 dieser Fälle waren Krankheitserreger bereits durch routinemäßige ante-mortem oder post-mortem Kulturen oder Nukleinsäure-Amplifikationstests (NAAT) identifizierbar, jedoch nur für post-mortem Proben.

Die Analyse der durchschnittlichen Anzahl von mNGS-Sequenzierungsreads oder des Anteils an Nicht-Wirt-Reads (Reads, die nicht auf das menschliche Genom abgebildet sind) ergab, dass die Kontrollverstorbenen einen niedrigeren Anteil an Nicht-Wirt-Reads im Vergleich zu Fällen mit infektiösen Todesursachen aufwiesen. Bemerkenswerterweise identifizierte mNGS bei 18 der 20 Fälle mit bekannten Krankheitserregern erfolgreich denselben Erreger, was eine beeindruckende Übereinstimmung von 90 % erreichte. Darüber hinaus entdeckte mNGS andere Mikroorganismen, die potenziell für neonatale Todesfälle verantwortlich sind, wie zum Beispiel Klebsiella aerogenes.

In 11 Fällen, in denen Todesfälle Infektionen zugeschrieben wurden, die mit herkömmlichen Methoden nicht vorläufig identifiziert werden konnten, spielte mNGS eine entscheidende Rolle, indem es in 9 dieser Fälle potenzielle Krankheitserreger identifizierte. Die Krankheitserreger wurden ausschließlich identifiziert durch mNGS eingeschlossen Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, und Streptococcus mucinisZusätzlich wurden in 14 Fällen mit positiven antemortem Blutkulturen die gleichen Mikroorganismen in 86 % dieser Fälle konsistent mit mNGS nachgewiesen.

Die metagenomische NGS-Metrik für verbleibende Reads nach der Filterung von Wirts- und Qualitätsdaten. (Baillie et al., 2023)

Das Forschungsteam analysierte sorgfältig die rohen gepaarten Endlese, die aus der mNGS-RNA-Bibliothek extrahiert wurden, um Antibiotikaresistenzgene (AMR) zu identifizieren. Die Ergebnisse zeigten das Vorhandensein von insgesamt 32 AMR-Genen innerhalb der mNGS-Daten, einschließlich Gene, die mit der Resistenz gegen β-Lactame, Aminoglykoside, Sulfonamide und andere assoziiert sind. Besonders bemerkenswert war die Vielfalt der Gene, die β-Lactamasen kodieren, mit der Identifizierung von insgesamt 12 verschiedenen Mutationen. Unter diesen Mutationen waren die im NDM-1-Gen gefundenen die häufigsten.

Bei einer umfassenden Bewertung der Häufigkeit von AMR-Genen wurde deutlich, dass Fälle, in denen der Erreger als Todesursache (CoD) identifiziert wurde, eine höhere Anzahl von AMR-Genen aufwiesen im Vergleich zu infektiösen Todesfällen, bei denen der Erreger nicht identifiziert werden konnte.

Antimikrobielle Resistenz (AMR) Gene in Proben von Neugeborenen, die an bekannten und unbekannten Krankheitserregern gestorben sind, unter Verwendung von RNA-Bibliotheken. (Baillie et al., 2023)

Das Forschungsteam bereitete sorgfältig DNA-Bibliotheken für insgesamt 18 Fälle vor und kategorisierte sie in zwei verschiedene Gruppen: eine bestehend aus 12 Fällen mit identifizierten Krankheitserregern und die andere aus 6 Fällen, in denen die Krankheitserreger unbekannt blieben. Innerhalb der Untergruppe der Fälle mit bekannten Krankheitserregern bewiesen die DNA-Bibliotheken ihre Leistungsfähigkeit, indem sie erfolgreich potenzielle ursächliche Erreger identifizierten. In sechs Fällen wurde der infektionserregende Mikroorganismus eindeutig bestimmt, wobei in allen Fällen das Vorhandensein von Acinetobacter baumannii, entweder durch Kultur oder durch Nukleinsäure-Amplifikationstests (NAAT).

Anschließend tauchte das Team tiefer in die sechs Fälle von A. baumannii Die zuvor erwähnten positiven Proben. Durch ihre sorgfältigen Bemühungen gelang es ihnen, umfassende Genomsequenzen mit bemerkenswerter Vollständigkeit zu erzeugen, die zwischen 92 % und 99 % lagen. Auffällig ist, dass alle diese Genome dem eng verwandten ST1-Typ angehörten, was die genetische Homogenität dieser Stämme unterstreicht.

Bemerkenswerterweise bewies die DNA-Bibliothek ihren Wert in den Fällen, in denen zunächst kein Pathogen nachgewiesen wurde, indem sie einen einzelnen Fall von enthüllte. Klebsiella pneumoniae.

Die gesamte Genom-Phylogenie der Genome der 9 Acinetobacter baumannii-Stämme, die aus 6 Neugeborenentodesfällen gesammelt wurden, wurde in den DNA-Bibliotheken für diese Studie zusammen mit 6 Referenzstämmen ausgewertet. (Baillie et al., 2023)

Anschließend führte das Forschungsteam eine gründliche Analyse der rohen paired-end DNA-Bibliothekslesungen durch, die aus den identifizierten mikrobiellen Proben gewonnen wurden, wobei der Schwerpunkt auf der Erkennung von Markern für antimikrobielle Resistenzen (AMR) lag. In dieser umfassenden Analyse entdeckten sie insgesamt 29 verschiedene AMR-Gene, die Resistenzen gegen β-Lactame, Aminoglykoside und Sulfonamide aufwiesen. Bemerkenswert ist, dass unter diesen Genen diejenigen, die β-Lactamasen und Aminoglykoside kodieren, eine bemerkenswerte Vielfalt zeigten, wobei jede Kategorie aus neun verschiedenen Genen bestand.

Antimikrobielle Resistenz (AMR) Gene in Proben von Neugeborenen, die an Infektionskrankheiten gestorben sind, unter Verwendung von DNA-Bibliotheken. (Baillie et al., 2023)

Die Ergebnisse dieser Studie deuten stark darauf hin, dass der Einsatz von klinischen metagenomische Next-Generation Sequenzierung (NGS) Postmortale minimal-invasive Gewebeentnahme (MITS) könnte sich als äußerst wertvoll erweisen, um pathogen-spezifische Ursachen von durch Infektionen bedingten Todesfällen bei Neugeborenen genau zu bestimmen. Darüber hinaus hat dieser wegweisende diagnostische Ansatz das Potenzial, die Behandlungsstrategien in neonatologischen Intensivstationen erheblich zu informieren, die frühzeitige Erkennung von aufkommenden Infektionen und Krankheitsprofilen zu erleichtern und eine entscheidende Rolle bei der Identifizierung und Kontrolle von Ausbrüchen von im Krankenhaus erworbenen Infektionen zu spielen. Darüber hinaus könnte die Anwendung in ressourcenarmen Ländern oder Regionen mNGS bietet einen vielversprechenden Ansatz zur Bewertung der krankheitsspezifischen Pathogenprävalenz und zur Identifizierung der vorherrschenden Gene für die Resistenz gegen antimikrobielle Medikamente, wodurch die gezielte Entwicklung pharmazeutischer Interventionen geleitet wird.

Referenz:

1. Baillie, Vicky L., et al. "Metagenomische Sequenzierung von postmortalen Gewebeproben zur Identifizierung von Krankheitserregern, die mit neonatalen Todesfällen in Verbindung stehen." Naturwissenschaftliche Kommunikation 14.1 (2023): 5373.