Entschlüsselung komplexer struktureller Variationen und DNA-Reparaturmechanismen durch Ganzgenomsequenzierung

HRD in Krebsgenomen

Krebsgenome dienen als Aufzeichnung genetischer Veränderungen, die aus DNA-Schäden und defekten DNA-Reparaturprozessen während der normalen Entwicklung von Zellen und dem Fortschreiten der Karzinogenese resultieren. Diese genetischen Veränderungen äußern sich als weit verbreitete somatische Veränderungen in BRCA1-defizienten (BRCA1d) und BRCA2-defizienten (BRCA2d) Krebserkrankungen, die hauptsächlich mit Defiziten in der homologen Rekombination (HR) verbunden sind, einem entscheidenden Weg zur Reparatur von Doppelstrangbrüchen (DSBs) in menschlichen Zellen. Einige dieser Mutationsmuster könnten spezifische fehleranfällige Mechanismen der DSB-Reparatur darstellen, die Zellen in Abwesenheit einer funktionalen HR einsetzen, und möglicherweise wertvolle Biomarker für die Identifizierung von HR-Defekten bieten sowie klinisch relevante therapeutische Strategien leiten.

Die beeinträchtigte DSB-Reparatur in HR-defizienten (HRD) Zellen ist oft mit Störungen der strukturellen genomischen Integrität verbunden, was zu charakteristischen zytogenetischen Abnormalitäten wie radialen Chromosomen und Chromosomenbrücken führt. Sowohl Mikroarray- als auch Whole-Genome-Sequenzierung (WGS) Studien haben umfangreiche Muster von heterozygoten Deletionen (Verlust der Heterozygotie oder LOH) und anderen allelischen Ungleichgewichten in HRD-Krebsarten aufgezeigt. Es ist erwähnenswert, dass solche Kopienzahlveränderungen auch in Tumoren mit intaktem HR (HRP) beobachtet werden können und nicht an spezifische Typen gebunden sind. strukturelle Varianten (SVs)Paradoxerweise umfassen die unterscheidenden genomischen Merkmale, die BRCA1d- und BRCA2d-Tumoren von HRP-Tumoren abgrenzen, Einzel-Nukleotid-Varianten (SNVs), kleine Deletionen, die durch Mikrohomozygotie gekennzeichnet sind, tandem Duplikationen und einfache Deletionen. Auffällig ist, dass diese Veränderungen minimale Auswirkungen auf die Chromosomenstruktur haben. Die Mechanismen, die erklären, wie abnormale DSB-Reparaturprozesse zu den damit verbundenen zytogenetischen Anomalien in Gegenwart von HR-Defekten führen, sind nach wie vor schlecht verstanden.

Komplexe strukturelle Variationen und Reparaturmechanismen in BRCA1- und BRCA2-defizienten Krebsarten

Kürzlich wurde ein Artikel veröffentlicht in NaturDiese Studie mit dem Titel „Langmolekulare Narben der Backup-DNA-Reparatur in BRCA1- und BRCA2-defizienten Krebsarten“ nutzte die Kraft von 46 tiefen Stranglesungen. Whole-Genome-Sequenzierung (WGS) Datensätze von Brustkrebs mit BRCA1- oder BRCA2-Mutationen. Darüber hinaus führte das Team eine Genomkartenanalyse von Short-Read-WGS-Daten aus Tausenden von Tumoren durch. Dieser umfassende Ansatz enthüllte eine einzigartige Klasse von Umstellungen, die als 'Reversal-Paare' bezeichnet werden und signifikant in HR-defizienten Krebsarten angereichert sind. Die Autoren schlugen einen Mechanismus für HR-unabhängige Replikation und Wiederherstellung vor, um das gesamte Spektrum der 'Reversal-Paar'-Ergebnisse zu erklären. Diese Entdeckung wirft Licht auf eine besondere Kategorie von Umstellungen, die spezifisch für BRCA1- oder BRCA2-Defizienzen sind und die zytogenetischen Abnormalitäten zugrunde liegen, die in HR-defizienten Zellen beobachtet werden.

Um die komplexe Rolle von strukturellen Variationen (SVs) bei Krebsarten, die mit einer Defizienz der homologen Rekombination (HRD) verbunden sind, zu untersuchen, sammelten die Forscher in dieser Studie sorgfältig Daten aus 979 Profilen der gesamten Genomsequenzierung, die hauptsächlich aus primären Tumoren (95 %) bestanden. Diese Tumoren repräsentierten vier verschiedene Typen, die häufig mit HR-Defekten in Verbindung gebracht werden. In diesem Datensatz gab es 24 und 36 Tumoren, die eine Inaktivierung beider BRCA1- und BRCA2-Allel aufwiesen, sowie 487 Tumoren, die mit Abnormalitäten im HR-Weg (HRP) assoziiert waren. Anschließend verwendeten die Forscher einen integrierten genomischen Mapping-Ansatz, um Kopienzahlveränderungen und Umstellungen zu analysieren, was eine vergleichende Bewertung der SV-Muster zwischen BRCA1-defizienten (BRCA1d), BRCA2-defizienten (BRCA2d) und HRP-Tumoren ermöglichte.

LR WGS zeigt cis- und trans-Phasen für ähnliche reziproke Paar-Topologien.

Die Ergebnisse zeigten bemerkenswerte Ähnlichkeiten in den SV-Profilen zwischen HRP- und HRD-Krebsarten, einschließlich komplexer SVs. Dennoch trat eine bemerkenswerte Ausnahme auf, da eine bestimmte Klasse von SVs, die als "Tandem Insertional Complexes" (TICs) bekannt ist, eine signifikante Anreicherung in BRCA1d- und BRCA2d-Tumoren aufwies.

Klassische umgekehrte Umstellungen, die durch Gleichgewichts-Translokationen oder Inversionen gekennzeichnet sind, sind Mechanismen, die ohne Nettoverlust oder -gewinn von genetischem Material auftreten und ein Paar von DNA-Junktionen betreffen, die benachbart zu den gebrochenen Enden innerhalb desselben Bruchpunkts positioniert sind. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass viele Umstellungen, einschließlich Translokationen und Inversionen, leicht von dieser klassischen Definition abweichen und Eigenschaften einer nahezu Umkehrung aufweisen. Diese nahezu umgekehrten strukturellen Varianten (SVs), wie TICs, beinhalten Änderungen der Kopienzahl innerhalb intermediärer genomischer Regionen, die als "Lückenfragmente" bezeichnet werden. Die Polarität dieser Änderungen wird durch die Ausrichtung der Verbindung der gebrochenen Enden bestimmt. Genauer gesagt führen Kopiergewinne zu Verbindungen zwischen gebrochenen Enden und Lückenfragmenten mit positiver Polarität (+), während Kopieverluste auftreten, wenn diese Verbindungen die flankierenden Segmente mit negativer Polarität (-) betreffen.

Während TICs in BRCA1d- und BRCA2d-Krebsarten deutlich angereichert waren, ist bemerkenswert, dass sie auch in einem erheblichen Anteil (36%) der HRP-Tumoren erkennbar waren. Dies deutet darauf hin, dass es möglich ist, durch eine umfassendere Analyse der nahezu umgekehrten Verbindungsstellen spezifische Muster der HR-Defizienz aufzudecken.

Reziproke Paare sind in BRCA1d- und BRCA2d-Tumoren angereichert.

Basierend auf diesen Hypothesen führten die Forscher eine umfassende Analyse durch, indem sie die strukturellen Variationen (SVs) in unmittelbarer Nähe zwischen verschiedenen Genotypen verglichen. Ihre Untersuchung ergab, dass gepaarte zirkulierende Muster in BRCA1-defizienten (BRCA1d) und BRCA2-defizienten (BRCA2d) Krebsarten deutlich häufiger vorkamen als in Hochrisikopopulationen (HRP). Diese gepaarten zirkulierenden Muster werden als "umgekehrte Paare" oder "reziproke Paare" bezeichnet.

Darüber hinaus identifizierten die Forscher bei der Visualisierung der Länge und Polarität von Gap-Fragmenten innerhalb dieser umgekehrten Paare drei distincte Submuster, die spezifisch für BRCA1-defiziente und/oder BRCA2-defiziente Krebserkrankungen sind:

• In BRCA1-defizienten Tumoren (BRCA1d) wurden umgekehrte Paare beobachtet, die durch zwei Lückenfragmente gekennzeichnet sind, die von 100 Basenpaaren bis 100 Kilobasen lang sind, beide mit positiver Polarität. Diese wurden als "umgekehrte Duplikate" (rDups) bezeichnet.
• In BRCA2-defizienten Tumoren (BRCA2d) fanden die Forscher umgekehrte Paare mit zwei Lückenfragmenten, die von 1 Basenpaar bis 10 Kilobasen lang waren, beide mit negativer Polarität. Diese wurden als "umgekehrte Deletionen" (rDel) bezeichnet.
• Zusätzlich identifizierten sie umgekehrte Paare, die Gap-Fragmente von 1 Basenpaar bis 100 Kilobasen Länge mit entgegengesetzten Polaritäten (positiv und negativ) enthielten. Diese umgekehrten Paare waren sowohl in BRCA1d- als auch in BRCA2d-Krebsarten angereichert und wurden als "reverse deletion-duplication" (rDelDup) bezeichnet.

Die Forscher führten verknüpfte Lesevorgänge (LR) und Standardanalysen durch. Whole-Genome-Sequenzierung (WGS) an 46 Tumorproben, die jeweils mit ihrem entsprechenden Normalprobe gepaart sind. Diese Proben wiesen genetische oder somatische Mutationen in den Genen BRCA1 oder BRCA2 auf. LR WGS bietet eine umfassende genomweite Abdeckung sowohl der Tumor- als auch der Normalproben, indem es barcodierte Kurzlesesequenzierung von langen DNA-Molekülen verwendet. Diese verlängerten DNA-Moleküle spielen eine entscheidende Rolle beim Entwirren von umgekehrten Paaren in phasierte somatische Haplotypen und beleuchten die zugrunde liegenden Mechanismen und Ergebnisse struktureller Variationen (SVs).

Die Ergebnisse dieser Studie zeigten die Konsistenz zwischen der LR WGS-Kartierung und der zuvor beschriebenen Analyse von Short-Read-WGS-Daten. Darüber hinaus offenbarte die LR WGS einen signifikanten Einblick in umgekehrte Paare mit identischen Umordnungsorientierungen, die zwei unterschiedliche chromosomale Ergebnisse erzeugen, die nur mithilfe von langen molekularen Daten unterschieden werden können. Das erste Ergebnis, bekannt als "cis", beinhaltet die Replikation eines kleinen DNA-Fragments, das an einen entfernten genomischen Ort übertragen wird. Das zweite Ergebnis, bezeichnet als "trans", stellt eine gut ausbalancierte Translokation oder eine Multi-Megabase-Inversion dar, die durch erhebliche Wiederholungen (ungefähr 10 kb) an jeder Verbindung gekennzeichnet ist. Interessanterweise zeigte die Untersuchung, dass trans-transversale Paare in Fällen von rDup, rDel und rDelDup verbreitet sind und zu umfangreichen Umordnungen in BRCA1d- und BRCA2d-Tumoren beitragen. Diese trans-umgekehrten Paare üben erhebliche chromosomale Effekte aus, die möglicherweise mit zytogenetisch beobachtbaren Abnormalitäten verbunden sind, die typischerweise mit der Inaktivierung von BRCA1 und BRCA2 assoziiert sind.

LR WGS deckt Fußabdrücke von SSA in BRCA2d-Genomen auf.

Differenzielle Expression und populationsspezifische Effekte, die möglicherweise durch genetische Faktoren bedingt sind

Durch die Nutzung von eQTLs zeigte unsere Analyse die Identifizierung von 9.150 eQTL-Loci, die mit 5.198 unterschiedlichen Genen assoziiert sind, von denen 11 % spezifische Muster in Bezug auf die Abstammung aufwiesen. Unter diesen wiesen 812 eQTLs eine Zelltyp-Spezifität auf, wobei 45 % von ihnen überwiegend in myeloischen Zellen nachgewiesen wurden. Darüber hinaus identifizierten wir 1.505 viralen Stimulus-antwort Varianten, bekannt als reQTLs, die mit 1.213 Genen verknüpft sind. Bemerkenswerterweise zeigten die genetischen Grundlagen der myeloischen Antwort virale Spezifität, mit Variationen zwischen Zellpopulationen.

Unsere Untersuchung zu interpopulationär unterschiedlich exprimierten Genen und differentiellen Effektgenen zeigte, dass 56 % bzw. 60 % von ihnen mit mindestens einem eQTL assoziiert waren. Dies deutet darauf hin, dass die Gene, die die signifikantesten populationsbasierten Variationen in der differentiellen Expression und den Effekten aufweisen, wahrscheinlich durch genetische Kontrolle beeinflusst werden, die oft mit bedeutenden Effekt-loci verbunden ist. Dies hebt die Existenz von Populationsunterschieden in spezifischen Untergruppen von Genen hervor. Zum Beispiel fanden wir zwischen Afrikanern und Europäern, dass ein einzelner Variant mit starker Populationsdifferenzierung 81-100 % der Variation in der GBP7-Expression erklären konnte.

eQTLs und reQTLs tragen zum Risiko von COVID-19 bei. (Aquino et al., 2023)

Eine eingehende Analyse enthüllte weiter die Präsenz von reversen SVs in sowohl cis- als auch trans-Orientierungen, die jeweils spezifische topologische und Bündellängenmerkmale aufweisen, die mit Mechanismen der Replikationsneustarts korrelieren. Bemerkenswerterweise umfassen diese Mechanismen Ergebnisse wie Halb-Crossover und Template-Einfügungen, die mit bruchinduzierter Replikation (BIR) assoziiert sind. Basierend auf diesen Erkenntnissen wird ein vorläufiges Modell vorgeschlagen, das nahelegt, dass mikrohomologievermittelte BIR das gesamte Spektrum der reversen Paarabbildung erklären könnte.

Zusätzlich, LR WGS identifizierte einen einzigartigen Reparaturweg, der als Einzelstrang-Annealing (SSA) bekannt ist und spezifisch für BRCA2-Defekte in menschlichen Krebserkrankungen ist. Diese Entdeckung hebt eine einzigartige Strategie hervor, um den Reparaturweg in Zellen mit homologer Rekombinationsdefizienz (HRD) zu verstärken.

Referenz

1. Setton, Jeremy, et al. "Lange Molekülnarben der Backup-DNA-Reparatur in BRCA1- und BRCA2-defizienten Krebsarten." Natur (2023): 1-9.