Qualitätskontrolle der ATAC-Sequenzierungsbibliothek

ATAC-seq (Assay zur Zielgerichteten Untersuchung von Zugänglichem Chromatin mit Hochdurchsatz-Sequenzierung) ist eine leistungsstarke Technik, die die Transpositions-Eigenschaften des Tn5-Enzyms nutzt, um offenes Chromatin, die Prägung von Transkriptionsfaktoren und die Lokalisierung von Nukleosomen zu untersuchen. Aufgrund der erheblichen Zeit- und Kostenaufwände, die mit der Sequenzierung verbunden sind, führen Forscher und Sequenzierungsunternehmen häufig Qualitätsprüfungen vor der Sequenzierung an den erstellten Bibliotheken durch. Diese Prüfungen umfassen verschiedene Parameter, wie die Bibliothekskonzentration und die Fragmentgröße, um zuverlässige und aussagekräftige Ergebnisse zu gewährleisten.

Empfohlene Lektüre: ATAC-Seq – Eine Methode zur Untersuchung von offenem Chromatin.

Im Vergleich zu anderen Sequenzierungsbibliotheken, ATAC-seq Bibliotheken stellen einzigartige Herausforderungen in Bezug auf die Qualitätsbewertung dar. Die Unsicherheit entsteht aus potenziellen Variationen zwischen Probenarten und Vorbehandlungen, die die Qualität der erzeugten Bibliotheken erheblich beeinflussen können.

ATAC-seq-Bibliotheken werden typischerweise aus intakten Kernen oder Zellen vorbereitet, wobei der Transposon die Kern- oder Zellmembran durchdringt, um auf das Innere der Chromatin zuzugreifen. Die Transpositionsreaktion integriert dann Sequenzierungsjunction-Sequenzen in die fragmentierte DNA. Die Zugänglichkeit des Chromatins kann jedoch von mehreren Faktoren beeinflusst werden, einschließlich Zelltyp, Zellzahl, Zellaktivität, Zellclusterbildung und der relativen Konzentration des Transposons zu DNA. Infolgedessen kann die Anzahl und Größe der Bibliotheksfragmente erhebliche Variabilität aufweisen.

Typisches TapeStation-Profil (in diesem Fall D1000 TapeStation) einer ATAC-seq-Bibliothek. (Maor-Nof et al., 2021)

Um diese Herausforderungen anzugehen und zuverlässige Daten zu gewährleisten, sind umfassende Qualitätskontrollmaßnahmen unerlässlich. Forscher bewerten sorgfältig die Bibliothekskonzentration und die Fragmentgrößenverteilung, um die Sequenzierungsbemühungen zu optimieren. Darüber hinaus kann das Verständnis der spezifischen Eigenschaften jeder Probe und die Berücksichtigung potenzieller Variationen dazu beitragen, die resultierenden Daten genau zu interpretieren.

Fragmentgrößenanalyse für ATAC-Seq-Bibliotheken

Für eine umfassende Bewertung von ATAC-Seq-Bibliotheken ist es entscheidend, die Verteilung der DNA-Fragmente nach der Bibliotheksamplifikation zu analysieren. Wir empfehlen dringend, einen DNA-Fragmentanalysator für diese Aufgabe zu verwenden. Durch die Erstellung eines Elektropherogramms der Fragmente können Forscher wertvolle Einblicke in die Fragmentgrößen und deren Peakformen gewinnen. Um genaue Ergebnisse zu gewährleisten, ist es ratsam, einen Test mit einer Auflösung von weniger als 1000 Basenpaaren (bp) zu verwenden.

Die Fragmentgrößenanalyse liefert wichtige Informationen über die Integrität und Effizienz der Bibliothek. Ein gut definierter und konzentrierter Peak im Elektropherogramm weist auf eine homogene Verteilung von DNA-Fragmenten innerhalb des gewünschten Bereichs hin. Im Gegensatz dazu können unregelmäßige Peakformen oder breite Größenverteilungen auf mögliche Probleme bei der Bibliotheksvorbereitung oder Amplifikation hinweisen.

Durch die Durchführung dieser Analyse können Forscher den Erfolg des ATAC-Seq Bibliotheksvorbereitung und fundierte Entscheidungen bezüglich der Sequenzierungsstrategie zu treffen. Letztendlich trägt dieser Schritt erheblich zur Zuverlässigkeit und Qualität der generierten Daten bei, was zu genaueren Interpretationen der Chromatinzugänglichkeit und der Kartierung regulatorischer Elemente führt.

Qualitätskontrolle von ATAC-Seq-Bibliotheken

Die grundlegende Einheit der eukaryotischen Chromatin ist das Nukleosom, das aus 147 Basenpaaren (bp) DNA besteht, die um ein Histon-Oktamer gewickelt sind, verbunden durch 20-90 bp lange DNA-Links. Die Kompaktheit des Chromatins, die durch seine Wechselwirkung mit Histonen bestimmt wird, spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Genexpression.

In Regionen offener Chromatinstruktur, wo DNA schwach mit Histonen interagiert, können Transkriptionspromotoren und Enhancer leicht an DNA binden, was die Transkription erleichtert. Im Gegensatz dazu haben Transkriptionsfaktoren in geschlossenen Chromatinregionen mit fester DNA-Histon-Bindung Schwierigkeiten, auf Promotor- und Enhancerregionen zuzugreifen, was die Transkription hemmt.

ATAC-Seq nutzt die Fähigkeit des modifizierten Tn5-Enzyms, auf offene Chromatinregionen zuzugreifen, indem es DNA in Fragmente schneidet und gleichzeitig die erforderlichen Adaptersequenzen für die Sequenzierung hinzufügt. Der Transpositionsprozess kann an verschiedenen Übergangsregionen zwischen Nucleosomen stattfinden, was zu kurzen Fragmenten (<90 bp) oder größeren Fragmenten mit Nucleosomen führt, die zwischen Tn5-geschnittenem DNA liegen.

Nach der Amplifikation der Bibliothek und der Hinzufügung von Illumina-Indizes liegen die Bibliotheksfragmente typischerweise im Bereich von etwa 200 bp bis 1000 bp. Spitzen zwischen 160-200 bp erscheinen aufgrund der Periodizität benachbarter Nukleosomen.

Die Größe und Form der ATAC-Seq-Bibliotheksfragmente kann zwischen den Proben aufgrund von Unterschieden in Zelltypen, Aktivitätsstatus, Zellzahlen und Probenverarbeitung erheblich variieren. Diese Variabilität hängt von zellspezifischen Eigenschaften und dem Verhältnis von Transposons zu DNA ab.

Die Variation der Nukleosomen-Spitzen wird durch die Häufigkeit der DNA-Spaltung durch Tn5 beeinflusst, jedoch korrelieren die Anzahl oder Größe der Spitzen nicht immer direkt mit der Qualität der Sequenzierungsdaten. Die Spitzenformen der Bibliothek ähneln oft einer Skipiste, anstatt ausgeprägte Spitzen zu zeigen.

Der entscheidendste Faktor für Bibliotheken ist jedoch, eine gute Verteilung der Fragmente im Bereich von 200-1000 bp, vorzugsweise unter 600 bp, aufzuweisen. Dieses Merkmal gewährleistet die Erfassung wesentlicher Informationen zur Chromatinzugänglichkeit und erhöht die Zuverlässigkeit der ATAC-Seq-Daten.

Optimierung der Transpositionsreaktion für eine effiziente ATAC-Seq-Bibliotheksvorbereitung

Die Transpositionsreaktion ist ein kritischer Schritt in der ATAC-Seq-Bibliotheksvorbereitung, der die Zugabe des Tn5-Enzyms umfasst, um auf Chromatin zuzugreifen und DNA in Fragmente zu schneiden. Ein unzureichendes Tn5 oder ein niedriges Tn5-zu-DNA-Verhältnis kann jedoch zu unzureichender Transposition führen, was zu einer Untertagmentierung führt. Dieses Phänomen ist durch große DNA-Fragmente gekennzeichnet, die sich um 800 bp konzentrieren.

Große Fragmente bringen mehrere Nachteile mit sich, wie ineffizientes Clustering auf Flusszellen, was zu einer geringeren Clustering-Dichte und einem reduzierten Sequenzierungsausstoß führt. Um die gewünschte Abdeckung zu erreichen, ist für größere Fragmente im Vergleich zu kleineren mehr Sequenzierung erforderlich.

Unter-Tagmentierung kann aus verschiedenen Faktoren resultieren, wobei eine unzureichende Nukleusvorbereitung eine häufige Ursache ist. Die Gewinnung gut getrennter und suspendierter Kerne aus Gewebeproben ist schwieriger als aus kultivierten Zellen, was die Unter-Tagmentierung in Gewebeproben häufiger macht.

Um Probleme mit Untertagging zu beheben, können die folgenden Vorschläge hilfreich sein:

• Stellen Sie sicher, dass die vollständige Resuspension in der Lysepuffer erfolgt, und homogenisieren Sie die Gewebeproben für eine optimale Nukleusvorbereitung.
• Verlängern Sie die Zelllysezeit auf Eis, um die Tn5-Aktivität zu erhöhen.
• Erhöhen Sie die Reaktionszeit der Transposase, um eine effiziente Spaltung zu fördern.
• Fügen Sie vor der Lyse einen zusätzlichen PBS-Waschschritt hinzu, um potenzielle Inhibitoren der Lyse in der Probe zu eliminieren.

Ein weiterer Grund für übergroße DNA-Fragmente könnte eine schlechte Probenqualität sein, insbesondere wenn tote Zellen übermäßige Mengen an freier DNA in der Zellaufhängung freisetzen. Diese überschüssige DNA kann die Tn5-Aktivität sättigen und deren Bindung an Chromatin-DNA verringern.

Um dieses Problem zu vermeiden, wird empfohlen, frische Zellen mit hoher Aktivität oder Zellen zu verwenden, die in einer Lösung aus 50 % FBS, 40 % Wachstumsmedium und 10 % DMSO eingefroren wurden. Bei Gewebeproben ist das Schnelleinfrieren in flüssigem Stickstoff und die Lagerung bei -80℃ entscheidend, um die Qualität der Proben zu erhalten. Experimente sollten zügig durchgeführt werden, und das Gewebe sollte nicht auftauen, bevor es auf Eis in einer Petrischale zerkleinert wird.

In Fällen, in denen FACS-sortierte Zellen verwendet werden, sollte Vorsicht walten, um Zellschäden während des Sortierprozesses zu minimieren. Verwenden Sie Sortiertechniken, die optimiert sind, um Schäden zu reduzieren, und streben Sie an, mit so vielen Zellen wie möglich zu beginnen. Darüber hinaus kann das Sortieren seltener Zellpopulationen mit weniger als 10 % Belegung mehr Schäden verursachen als das Sortieren von Zellen mit hoher Belegung (z. B. 70 %).

Neben den genannten Vorsichtsmaßnahmen sind präzise experimentelle Manipulationen und Aufmerksamkeit für Details während des experimentellen Prozesses entscheidend, um inter-sample Fehler zu minimieren.

Bibliotheksausbeuten von ATAC-Seq

Beim Start mit 50.000-100.000 frischen Zellen kann eine ideale Ausbeute von 400-600 ng erzielt werden. Diese Ausbeute wird in einem endgültigen Elutionsvolumen von 20 μL erreicht, mit einer Konzentration von etwa 20-30 ng/μL.

Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass FACS-sortierte Zellen aufgrund von Zellschäden während des Sortierprozesses geringere Mengen an DNA liefern können. Darüber hinaus kann die Unvertrautheit mit den Schritten, wenn es das erste Mal ist, dass das ATAC-Seq-Experiment durchgeführt wird, zu DNA-Verlust während der experimentellen Abläufe führen.

Um den Probenverlust zu minimieren, insbesondere beim Arbeiten mit SPRI-Magnetperlen, ist ein sanfter Ansatz entscheidend. Ethanol sollte vorsichtig am Boden des Röhrchens hinzugefügt werden, sodass es langsam aufsteigt, ohne die Magnetperlen zu stören. Eine Übertrocknung der Perlen sollte vermieden werden, da sie zu einem Bruch der Perlen und erheblichen Probenverlust führen kann. Bei der DNA-Säulenausreinigung sorgt das Hinzufügen des Elutionspuffers in die Mitte der Säule für eine effiziente DNA-Rückgewinnung.

Für ATAC-Seq-Experimente sind relativ geringe Mengen DNA für die Sequenzierung erforderlich. Daher ist der Ertrag zwar wichtig, aber es ist nicht notwendig, übermäßig darauf zu fokussieren. Solange genügend DNA für die Sequenzierung vorhanden ist und die Bibliotheksfragmente zufriedenstellend erscheinen, können die Bibliotheken zur Sequenzierung weitergegeben werden.

Variabilität in ATAC-Seq-Bibliotheken

Es ist üblich, Unterschiede in den Peakformen zwischen ATAC-Seq-Bibliotheksfragmenten aus verschiedenen experimentellen Proben und sogar zwischen verschiedenen Chargen des Bibliotheksvorbereitungsprozesses zu beobachten. Diese Variationen können durch Faktoren wie die Anzahl der verwendeten Zellen, die Bedingungen der Zelllyse oder andere subtile Unterschiede, die die Spaltfrequenz von Tn5 oder pA-Tn5 beeinflussen, entstehen.

Trotz solcher Variationen in der Häufigkeit der Spaltung und der daraus resultierenden Unterschiede im Erscheinungsbild der Bibliotheksfragmente kann die Qualität der Sequenzierungsdaten stabil und zuverlässig über diese Proben hinweg bleiben. Diese Stabilität ist hauptsächlich darauf zurückzuführen, dass die Datenpeaks weitgehend von der Zugänglichkeit von Tn5 zu offener Chromatin oder pA-Tn5 zu Antikörpern bestimmt werden.

Während das Erscheinungsbild der Spitzenformen der Bibliothek als qualitativer Indikator dienen kann, um zu entscheiden, ob mit der Sequenzierung fortgefahren werden soll, ist es wichtig zu verstehen, dass die Qualität der Bibliothek allein keinen Erfolg bei der Sequenzierung garantiert. Die Ergebnisse der Qualitätskontrolle (QC) der Bibliothek können jedoch wertvolle Einblicke in die Wahrscheinlichkeit des Sequenzierungserfolgs bieten und Möglichkeiten zur Prozessoptimierung basierend auf den QC-Ergebnissen eröffnen.

Um eine genaue Quantifizierung der Bibliothek sicherzustellen, sollten qPCR-basierte Assays verwendet werden. Dieser Schritt erhöht das Vertrauen in die Eignung der Bibliothek für das Sequenzieren und erleichtert fundierte Entscheidungen im Sequenzierungsworkflow.

Zusammenfassend ist das Verständnis der Variabilität in den Fragmentspitzen von ATAC-Seq-Bibliotheken entscheidend für die effektive Interpretation von Sequenzierungsergebnissen. Während das Auftreten von Spitzen den Entscheidungsprozess leiten kann, trägt eine umfassende Qualitätskontrolle der Bibliothek sowie die quantitativen PCR-basierten Messungen zur erfolgreichen Durchführung von ATAC-Seq-Experimenten und zur Generierung bedeutungsvoller epigenetischer Erkenntnisse bei.

Referenz:

1. Beck, Daniel, Millissia Ben Maamar und Michael K. Skinner. "Vergleich von genomweiten CpG-Dichten und Methoden zur DNA-Methylierungsanalyse (MeDIP, RRBS und WGBS)." Epigenetik 17,5 (2022): 518-530.