Polysom-Sequenzierung und Multi-Omics-Integration: Verknüpfung von Translation mit Transkriptomik und Proteomik

Polysomsequenzierung (Polysome-seq) ist die Goldstandardtechnik zur Untersuchung der Übersetzungseffizienz. Sie trennt aktive translationalen mRNAs, die an ≥2 Ribosomen gebunden sind, durch Sukrose-Dichtegradientenzentrifugation. Im Gegensatz zu Ribo-seq (das ribosomen-geschützte Fragmente, RPFs, erfasst), Polysom-Sequenzierung konzentriert sich auf polysomgebundene mRNAs und bewertet direkt die translationalen Aktivitäten sowie die translationalen Kapazitäten von nicht-kodierenden RNAs.

Hauptmerkmale von Polysome-seq:

• Quantifizierung der Übersetzungseffizienz: Der Polyribosomen-Score (PS) wird basierend auf dem Verhältnis von polysomgebundenem mRNA zu gesamter mRNA berechnet und spiegelt die translationalen Aktivitäten wider.

• Dynamische Überwachung: Erfasst Ribosomenstillstände, Kollisionsevents und stressinduzierte translationsbedingte Veränderungen (z. B. erhöht oxidativer Stress den Anteil monosomaler mRNAs).

• Nicht-kodierende RNA-Detektion: Erkennt die Translation atypischer Regionen (z. B. lncRNA/circRNA) durch Ribosomenbindung.

Beispiel für Polysomen-Profiling (Ye Y et al., 2021)

Multi-Omics-Integrationsrahmen

Um Transkription, Translation und posttranslationalen regulatorischen Ebenen zu verbinden, muss Polysome-seq mit RNA-Seq (transkriptomik) und proteomik (wie LC-MS/MS oder DIA-MS), um eine Systembiologie-Analysepipeline zu erstellen und Engpässe in der Genexpression sowie regulatorische Netzwerke zu erhellen.

Integrationsstrategien

• Datenstandardisierung:
  • RNA-Seq: Bietet Informationen über die Transkriptmenge und alternative Spleißung.
  • Polysom-Seq: Quantifiziert die Übersetzungseffizienz (TE = polyribosomales mRNA / gesamtes mRNA).
  • Proteomik: Misst die Proteinmenge und posttranslationalen Modifikationen (PTMs).

Schlüsselanalytische Methoden

• Korrelationsanalyse: Vergleicht mRNA-Spiegel aus RNA-Seq mit Proteinmengen aus der Proteomik, um posttranskriptionale Regulation zu identifizieren.

• Co-Expressionsnetzwerke: Korrelate Polysome-seq TE-Werte mit RNA-seq- und Proteomik-Daten, um hoch translational aktive Wege (wie Stressreaktionen) zu kartieren.

• Strukturgleichungsmodellierung (SEM): Quantifizierung der Beiträge von transkriptioneller und translationaler Regulation zur Proteinexpression.

Multi-Omics-Integrationsstrategie

(1) Kombinierte Analyse mit Transkriptom

Wu J et al. isolierten ribosomengebundene mRNAs (nicht-Polysom, leichtes Polysom und schweres Polysom) unter Verwendung von Polysom-ProfilierungKombiniert mit RNA-seq-Analysen fanden sie heraus, dass die Hemmung von EPRS (z. B. durch den PRS-spezifischen Inhibitor HF) den Anteil an prolinreichen Genen (PRRs, wie Kollagen, LTBP2 und SULF1) in schweren Polysomen (hohe translationaler Aktivität) signifikant reduzierte, was zeigt, dass ihre Translationseffizienz durch EPRS reguliert wird.

Dreiundachtzig PRR-Gene wurden identifiziert (Online-Tabelle IX/X). Diese Gene sind auf posttranskriptionaler Ebene durch HF herunterreguliert und stellen einen wesentlichen Teil der ECM und sekretorischen Signalmoleküle dar, was sie zu wichtigen Zielstrukturen für die myokardiale Fibrose macht.

Die integrierte Analyse von Polysom-Sequenzierung und RNA-Sequenzierung zeigte, dass EPRS, indem es die Übersetzungseffizienz von PRR-Genen (wie Kollagen, LTBP2 und SULF1) reguliert, zu einem entscheidenden Treiber der kardialen Fibrose wird und eine Grundlage für eine antifibrotische Therapie bietet, die auf EPRS oder dessen nachgelagerte Effektoren (wie SULF1) abzielt.

Pro-reiche Gene sind bevorzugte translationalen Ziele von EPRS (Wu J et al., 2020)

Wang Z et al. fanden durch Multimer-Analyse (Sucrose-Gradienten-Zentrifugation zur Trennung von Multimeren) in Kombination mit RNA-seq heraus, dass der ospus1-1-Mutant (Verlust der OsPUS1-Funktion) bei niedrigen Temperaturen Folgendes aufwies:

• Abnormale Chloroplasten-Ribosomenassemblierung (Multimerprofil zeigt Ribosomenfehler) und verringerte translationaler Aktivität (reduzierter Anteil an mehreren Multimern);

• Reduziertes reifes rRNA, angesammeltes Vorläufer-rRNA und inhibierte Ribosomenbiosynthese.

RNA-Seq und die Analyse der differentiellen Expression (edgeR) zeigten, dass im ospus1-1-Mutanten die Expression von photosynthesebezogenen Genen herunterreguliert war (Wachstumshemmung), während die Expression von Stressantwortgenen hochreguliert war (induzierte ROS-Akkumulation);

Die ROS-Detektion zeigte eine starke Ansammlung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) im Mutanten bei niedrigen Temperaturen, was die zelluläre Homöostase störte und das Netzwerk der Genexpression weiter beeinträchtigte (durch die retrograde Signalregulation nukleärer Gene). Die SeqHB-LMPCR-Sequenzierung bestätigte die Bindung von OsPUS1 an das Chloroplasten-Vorläufer-rRNA (pre-rRNA);

Quantitative RT-PCR validierte unterschiedlich exprimierte Gene (wie Stressgene);

Die Genontologie-Analyse (TBtools) ergab, dass OsPUS1 Wege wie die Ribosomenbiosynthese und die Translation reguliert.

Die Integration von Polysomen-Sequenzierung und Multi-Omics-Technologien zeigte, dass OsPUS1 durch die Vermittlung der Ψ-Modifikation von Chloroplast-rRNA die Ribosomenfunktion und die Translationseffizienz aufrechterhält, das Wachstum und die Stressreaktion ausbalanciert und ein wichtiger Regulator der Kältetoleranz von Reis ist. Diese Entdeckung bietet ein neues Ziel zur Verbesserung der Kältetoleranz von Pflanzen (zum Beispiel durch Regulierung der OsPUS1-Expression oder der rRNA-Modifikation).

Die Homöostase des Transkriptoms und Translatoms ist bei den Reis-Mutanten ospus1-1 bei niedrigen Temperaturen betroffen (Wang Z et al., 2022).

(2) Proteomische Assoziation

Li Q et al. fanden durch Multimer-Analyse (Sucrose-Gradientenzentrifugation zur Trennung von ribosomengebundenem mRNA), kombiniert mit qRT-PCR und Proteomik, heraus, dass: bei Überexpression von YTHDF1 mRNA von ATG2A/ATG14 in Multimeren angereichert war (hohe translational Aktivität) und die Translationseffizienz signifikant erhöht war; nach Knockdown/Entfernung von YTHDF1 nahm die Translationseffizienz von ATG2A/ATG14 ab und die Expression des autophagiebezogenen Proteins (LC3) verringerte sich.

ChIP-Analysen und duale Luciferase-Reporter-Assays bestätigten, dass HIF-1α unter hypoxischen Bedingungen direkt an den YTHDF1-Promotor bindet und dessen Transkription aktiviert (YTHDF1 ist in HCC-Geweben hoch exprimiert und mit einer schlechten Prognose verbunden).

MeRIP-seq und Ruhe in Frieden zeigte, dass YTHDF1 die Stabilität und Translation von ATG2A/ATG14 mRNA erhöht, indem es die m6A-Modifikationsstelle erkennt (Die Analyse der RNA-Stabilität zeigte, dass die Halbwertszeit der ATG2A/ATG14 mRNA nach der Knockdown von YTHDF1 verkürzt wurde). Polysom-Sequenzierung und Multi-Omics-Integration deuten darauf hin, dass YTHDF1 ein wichtiger Regulator der hypoxieinduzierte Autophagie in HCC ist. Es aktiviert ATG2A/ATG14 durch m6A-abhängige Translation und fördert die maligne Progression. YTHDF1 könnte als prognostischer Biomarker und therapeutisches Ziel für HCC dienen (z. B. durch Hemmung von YTHDF1 oder seinen nachgeschalteten Autophagie-Genen).

MeRIP-seq und Proteomik identifizierten potenzielle Ziele von YTHDF1 in HCC (Li Q et al., 2021)

Bhaduri U et al. fanden durch Polysomen-Sequenzierung und RNA-seq heraus, dass die Stummschaltung von TRIM8 folgendes zur Folge hatte:

• signifikante Hochregulierung von multisomalen-bindendem MALAT1 lncRNA (MALAT1 interagiert mit miR-561 zur Regulierung von TOP2A, und dessen Knockdown induziert G0/G1-Arrest);

• veränderte translational Aktivität, die die Übersetzungseffizienz von Autophagie-Genen wie ATG2A/ATG14 beeinflusst (Änderungen der Proteinexpression wurden durch LC-MS/MS verifiziert).

ScRNA-seq und die Analyse der differentiellen Expression zeigten, dass die Depletion von TRIM8 den Weg der "Regulation des chromosomalen Replikationszyklus" stört und die Genexpression in den Phasen G0/G1/S/G2/M (wie TOP2A und MCM-Komplexproteine) beeinflusst;

Die Durchflusszytometrie (BrdU/7-AAD) bestätigte, dass die Stummschaltung von TRIM8 zu einer Heterogenität des Zellzyklus und einer Ansammlung in der G0/G1-Phase führte (was mit der durch die Hochregulierung von MALAT1 induzierten Arrest übereinstimmt). Die LC-MS/MS-Proteomik identifizierte unterschiedlich exprimierte Proteine, die von TRIM8 reguliert werden (wie CEP170 und Komponenten des MCM-Komplexes), die im Zentrosom-/Spindelweg angereichert sind.

RT-qPCR+ChIP weiterhin wurde die transkriptionale/translationalen Regulation von Zielgenen (wie MALAT1 und TOP2A) durch TRIM8 validiert, und Wundheilungsassays zeigten, dass TRIM8 die Zellmigration beeinflusst.

Die Polysom-Sequenzierung und die Integration von Multi-Omics haben gezeigt, dass TRIM8 als wichtiger Regulator mehrerer Phasen der Mitose (Zentrosomenreplikation-Chromosomenreplikation-Zytokinese) wirkt, indem es die Übersetzungseffizienz von polysom-bindenden RNAs (wie MALAT1) reguliert, die Expression von Zellzyklusgenen (TOP2A/MCM) aufrechterhält und die primäre ziliäre Assemblierung fördert, was eine Grundlage für die Krebstherapie bietet (wie das gezielte Anvisieren der TRIM8-mitotischen Regulierungsachse).

Differenzielle Proteomik (LC-MS/MS) und Translatomik (Polysom-Profiling mit RNA-seq) Studie zur Stummschaltung von TRIM8 in RPE-Zellen (Bhaduri U et al., 2025)

(3) Integration mit der Gruppe der epigenetischen Modifikatoren

Chen Z et al. fanden durch die Sequenzierung von multi-Ribosomen-assoziierter mRNA (TE = FPKM der multi-Ribosomen-mRNA / FPKM der Gesamt-RNA) in Kombination mit qPCR Folgendes heraus:

• Nach der Knockdown von METTL1/WDR4 nahm der Anteil der Ziel-mRNAs (wie Gene mit m7G-bezogenen Codons) in Multi-Ribosomen (hohe translational Aktivität) ab, und die Translationseffizienz wurde signifikant reduziert;

• Die Überexpression von Wildtyp METTL1 (nicht-katalytisches Todesmutant) erhöhte die Translationseffizienz von Ziel-mRNAs und förderte das Fortschreiten des HCC.

LC-MS-Quantifizierung von tRNA-Modifikationen: Nach der Knockdown von METTL1 nahm der Prozentsatz der tRNA m7G-Modifikation ab (z. B. reduzierte m7G-Modifikation in tRNA-LysCTT);

TRAC-seq (tRNA m7G Reduktions- und Spaltungssequenzierung) identifizierte m7G-Modifikationsstellen (z. B. Positionen 46-48 in tRNA-LysCTT), und die Anreicherung von m7G-modifizierten tRNAs wurde durch anti-m7G Immunpräzipitation qPCR verifiziert.

Multi-Omics-Integration: Die TCGA-Datenanalyse zeigte, dass METTL1/WDR4 in HCC stark exprimiert wird und mit fortgeschrittenem Stadium und niedriger Überlebensrate assoziiert ist; RNA-seq/Proteomik validierten Veränderungen in der Expression von Zielgenen (wie Genen, die mit Proliferation und Migration in Verbindung stehen).

Polysom-Sequenzierung und Multi-Omics-Integration deuten darauf hin, dass METTL1/WDR4 die Übersetzungseffizienz von mRNAs mit m7G-bevorzugten Codons erhöht, indem es die m7G-Modifikation von tRNA katalysiert, was den malignen Phänotyp von HCC vorantreibt und eine Grundlage für die HCC-Therapie bietet, die auf die m7G-tRNA-Modifikation abzielt.

METTL1 reguliert das m7G tRNA Methylom, die tRNA-Expression und die globale mRNA-Translation (Chen Z et al., 2021)

Lu X et al. fanden durch multisomales Profiling (kombiniert mit qRT-PCR) heraus, dass: bei Überexpression von YTHDF1 mRNA von SLC7A11 in multisomalen Komplexen angereichert war (hohe translational Aktivität) und die Translationseffizienz signifikant erhöht war; nach Knockdown von YTHDF1 nahm die Translationseffizienz von SLC7A11 ab, die Expression des anti-Ferroptose-Proteins GPX4 nahm ab und die Ferroptose-Niveaus stiegen.

Der Dual-Luciferase-Reporter-Assay und die ChIP-PCR bestätigten, dass HIF-1α unter hypoxischen Bedingungen direkt an den Promotor von YTHDF1 bindet und dessen Transkription aktiviert (YTHDF1 ist hochgradig in NPCs exprimiert und mit Anti-Ferroptose assoziiert).

RIP-Analysen zeigte, dass YTHDF1 die m6A-Modifikationsstelle der SLC7A11-mRNA (vorhergesagt durch SRAMP) durch seine YTH-Domäne erkennt, was die Stabilität und Translation der mRNA erhöht.

RNA-Stabilitätstests (Behandlung mit Actinomycin D) zeigten, dass der Knockdown von YTHDF1 die Halbwertszeit von SLC7A11-mRNA verkürzte (beschleunigte Abbau).

Protein-Stabilitätstests (CHX-Behandlung) zeigten, dass YTHDF1 die Akkumulation des SLC7A11-Proteins fördert (verstärkte Translation kompensiert den Abbau).

Die Polysom-Sequenzierung und die Integration von Multi-Omics haben gezeigt, dass YTHDF1 ein wichtiger downstream translationaler Regulator von HIF-1α ist, der SLC7A11 durch m6A-abhängige Translation aktiviert und den systemischen Xc⁻-GSH-GPX4-Anti-Ferroptose-Weg aufrechterhält, was ein neuartiges Ziel für die IVDD-Therapie bietet (wie die Regulierung der HIF-1α-YTHDF1-SLC7A11-Achse).

YTHDF1 fördert die Translation von SLC7A11-mRNA, nachdem es daran bindet (Lu X et al., 2024)

Herausforderungen und zukünftige Richtungen

• Technische Einschränkungen:

• Polysome-seq basiert auf einer großen Anzahl von Zellen (≥1×10⁷), was seine Anwendung in seltenen Proben einschränkt.

• Kurzzeit-Sequenzierung (wie Ribo-seq) ist anfällig für Verzerrungen bei der Ribosomenverteilung, was die Kombination mit Langlesetechniken erforderlich macht, um komplexe ORFs zu analysieren.

• Grenzrichtlinien:

• Räumliche Translationomics: Kombination von Techniken der räumlichen Transkriptomik zur Analyse der translationalen Heterogenität im Gewebe-Mikroenvironment.

• Integration von Künstlicher Intelligenz: Nutzung von Deep Learning zur Vorhersage translationaler regulatorischer Netzwerke, wie z.B. Multi-Omics-Datenfusionsmodelle basierend auf GNNs.

Zusammenfassung

Polysom-Sequenzierung und Multi-Omics-Integration bieten eine panoramische Perspektive zur Analyse der translationalen Regulation und zeigen starke analytische Fähigkeiten von molekularen Mechanismen (wie RNA-Modifikation und Ribosomdynamik) bis hin zu physiologischen und pathologischen Prozessen (wie Stressreaktion und Tumorentstehung). Zukünftige Bemühungen müssen technologische Engpässe überwinden und die Entwicklung von Cross-Omics-Algorithmen vertiefen, um die Komplexität der translationalen Regulation vollständig zu enthüllen.

Die Leute fragen auch

Wie integriert man Multi-Omics-Daten?

Die Integration von Multi-Omics-Daten umfasst typischerweise die Verwendung von computergestützten Methoden, um Daten aus verschiedenen molekularen Schichten (z. B. Genomik, Transkriptomik, Proteomik), um umfassende biologische Erkenntnisse zu gewinnen.

Was sind die Konzepte der Genomik, Transkriptomik, Proteomik und Metabolomik?

Die Genomik untersucht das vollständige Set an DNA in einem Organismus, die Transkriptomik analysiert alle RNA-Moleküle, die Proteomik untersucht die gesamte Palette an Proteinen, und die Metabolomik konzentriert sich auf das umfassende Profil von kleinen Molekülmetaboliten.

Was ist der Unterschied zwischen Transkriptomik und Proteomik?

Die Transkriptomik untersucht das gesamte Set an RNA-Transkripten, um die Genexpression zu bewerten, während die Proteomik sich auf das gesamte Komplement an Proteinen konzentriert, um deren Häufigkeit, Modifikationen und Funktionen zu bestimmen.

Was sind die Herausforderungen bei der Integration von Multi-Omics-Daten?

Die Integration von Multi-Omics-Daten stellt jedoch erhebliche Herausforderungen dar, aufgrund der hohen Dimensionalität, Heterogenität, experimentellen Lücken und der Häufigkeit fehlender Werte über die Datentypen hinweg.

Was ist die Integration von Multi-Omics?

Multi-Omics-Datenintegration ist ein Begriff, der den Prozess beschreibt, Daten aus verschiedenen omischen Experimentierquellen, wie Genomik, Transkriptomik, Methylierungsassays und mikroRNA-Sequenzierungunter anderem.

Referenzen

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