Richtlinien zur Einreichung von Proben
Metagenom-Sequenzierung Q&A
Allgemeine Fragen
- Was sind die Unterschiede zwischen Metagenom und mikrobieller Vielfalt?
- (1) Experimenteller Unterschied: Mikrobielle Diversität zielt hauptsächlich auf die Amplifikation und Sequenzierung von ribosomalen kleinen Untereinheitsgen-Sequenzen (16s rDNA oder 18s rDNA) ab, während Metagenom-Sequenzierung erfordert lediglich die Fragmentierung von DNA, die durch Extraktion gewonnen wurde.
(2) Analytische Unterschiede: Die Sequenzierung der mikrobiellen Vielfalt erfordert die OTU-Klassifizierung und kann nur die Klassen- und Kompositionsverhältnisse von Arten untersuchen, während die Metagenom-Sequenzierung die Sequenzzusammenstellung und -bewertung erfordert und gleichzeitig auf Arten-, Gen- und Funktionsebene analysiert und untersucht werden kann. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die mikrobielle Vielfalt uns hauptsächlich sagt, welche Mikroorganismen in der Umwelt vorhanden sind, während Metagenome uns hauptsächlich darüber informieren, was die Mikroorganismen in der Umwelt tun können.
- (1) Experimenteller Unterschied: Mikrobielle Diversität zielt hauptsächlich auf die Amplifikation und Sequenzierung von ribosomalen kleinen Untereinheitsgen-Sequenzen (16s rDNA oder 18s rDNA) ab, während Metagenom-Sequenzierung erfordert lediglich die Fragmentierung von DNA, die durch Extraktion gewonnen wurde.
- Wie wählt man zwischen Metagenom-Sequenzierung oder Diversitätsanalyse?
- Die Wahl hängt vom Zweck Ihrer Studie ab. Wenn Sie sich nur auf die Gemeinschaftszusammensetzung der Umwelt konzentrieren, einschließlich der dominanten und nicht-dominanten Gattungen, dann ist die mikrobielle Diversität ausreichend. Wenn Sie jedoch tiefere funktionale Informationen basierend auf der Gemeinschaftszusammensetzung weiter erforschen müssen, wird die Metagenom-Sequenzierung empfohlen. Alternativ kann eine große Stichprobengröße für die Analyse der mikrobiellen Diversität verwendet werden, und geeignete Proben können basierend auf den Ergebnissen der Diversitätsanalyse für die Metagenom-Sequenzierung ausgewählt werden, um die funktionalen Eigenschaften der Gemeinschaftsarten auf eine tiefere Weise zu erkunden.
- Was ist der Unterschied zwischen Metagenom und Metatranskriptom?
- Metagenomik ist das Studium der DNA aller Mikroorganismen in der Umwelt, und Metatranskriptomik ist das Studium von RNA aller Mikroorganismen in der Umwelt. Das Metagenom sagt uns, was alle Mikroorganismen in der Umwelt tun können, und das Metatranskriptom sagt uns, was alle Mikroorganismen in der Umwelt gerade tun.
- Wie führt man eine Metagenom-Assemblierung durch?
- Nach dem Erhalt der Metagenomsequenz ist es notwendig, eine Qualitätskontrollanalyse durchzuführen, um die Verbindungsstücke und Sequenzen niedriger Qualität zu entfernen, bevor die Gensequenz assemblierte wird. Die Assemblierung ist der Prozess, bei dem eine Reihe von kurzen Sequenzen, die durch Sequenzierung erhalten wurden, zu einer kontinuierlichen langen Sequenz zusammengesetzt wird, d.h. es ist der Prozess des Zusammensetzens von kurzen Sequenzen zu langen Scaffold-Sequenzen.
- Warum eine Metagenom-Assemblierung durchführen?
- 1) Weniger Rechenzeit für Sequenzvergleiche nach der Assemblierung.
2) Das Genom kann rekonstruiert werden.
3) Die aktuelle Lese-Länge der Sequenzen für die zweite Generation der Sequenzierung ist kürzer.
- 1) Weniger Rechenzeit für Sequenzvergleiche nach der Assemblierung.
- Welche Faktoren sind mit der Effektivität der Metagenomassemblierung verbunden?
- Der Effekt der Metagenomassemblierung hängt hauptsächlich von der Menge der Sequenzierungsdaten der Proben, der Vielfalt der Arten und der Verteilung der Artenhäufigkeit ab, was dazu führen kann, dass die Metagenomassemblierung schwieriger ist als die von Einzelarten wie Bakterien. Dies ist der Schwerpunkt der aktuellen Metagenomforschung, der durchbrochen werden soll.
- In der Metagenom-Assemblierung können nicht alle Proben-Daten zusammengeführt werden, weil unterschiedliche Proben unterschiedliche mikrobiologische Gemeinschaften und genetische Diversität aufweisen. Das Zusammenführen aller Daten kann zu einer Überlagerung von Sequenzen führen, die nicht miteinander verwandt sind, was die Assemblierung erschwert und die Qualität der Ergebnisse beeinträchtigen kann. Zudem können technische Artefakte und unterschiedliche Sequenzierungsbedingungen die Daten verzerren, was zu fehlerhaften oder ungenauen Assemblierungen führen kann. Daher ist es oft besser, Proben separat zu analysieren und dann die Ergebnisse zu vergleichen oder zu integrieren.
- Die hochabundanten Arten in verschiedenen Proben sind sehr unterschiedlich. Wenn alle Proben zur Assemblierung gemischt werden, wird die Komplexität der Daten erheblich erhöht und der Assemblierungseffekt könnte schlechter sein.
- Im Montageprozess ist es so, dass die häufig vorkommenden Gene mit hoher Häufigkeit assembliert werden können, während die individuell spezifischen Gene mit niedriger Häufigkeit nicht assembliert werden können?
- 1) Aufgrund des Einflusses von Sequenzierungstiefe und Sequenzierungskosten wird in dem aktuellen Metagenom-Artikel die Menge an Sequenzierungsdaten in der Regel auf 6G festgelegt, was die meisten Mikroorganismen in der Probe nachweisen kann. Für einige Arten mit geringer Häufigkeit ist es jedoch tatsächlich wahrscheinlich, dass sie aufgrund der Sequenzierungstiefe nicht assembliert werden können;
2) Bei der Metagenomanalyse konzentriert man sich im Allgemeinen mehr auf die Zusammensetzung von Arten mit hoher Abundanz. Wenn Sie spezielle Analysen für Arten mit niedriger Abundanz durchführen möchten, müssen Sie in der Regel das Volumen der Sequenzierungsdaten erhöhen oder einige spezielle Behandlungen im Vorab-Extraktionsprozess durchführen, um so viele Arten mit niedriger Abundanz wie möglich anzureichern, und anschließend die Sequenzierungsanalyse durchführen.
- 1) Aufgrund des Einflusses von Sequenzierungstiefe und Sequenzierungskosten wird in dem aktuellen Metagenom-Artikel die Menge an Sequenzierungsdaten in der Regel auf 6G festgelegt, was die meisten Mikroorganismen in der Probe nachweisen kann. Für einige Arten mit geringer Häufigkeit ist es jedoch tatsächlich wahrscheinlich, dass sie aufgrund der Sequenzierungstiefe nicht assembliert werden können;
- Was ist die empfohlene Sequenzierungsmenge für verschiedene Proben?
- Die Sequenzierungsvolumina variieren im Allgemeinen je nach Komplexität der Umweltprobe. Für Probenarten mit komplexer mikrobieller Zusammensetzung, wie z. B. Bodenproben, wird ein Sequenzierungsvolumen von 12G empfohlen, während für Proben mit relativ einfacher mikrobieller Zusammensetzung, wie z. B. Darmproben, in der Regel ein Sequenzierungsvolumen von 6G empfohlen wird.
- Kann die Metagenom-Sequenzierung Informationen über Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze, Protozoen, Plankton und Viren erkennen?
- Ja, weil die durch Metagenom-Sequenzierung extrahierte DNA die gesamte DNA der Organismen in der Umweltprobe ist, die sequenziert und analysiert werden kann, um gleichzeitig Informationen über Bakterien, Pilze, Protozoen, Plankton und Viren (DNA-Viren) in der Umwelt zu erkennen.
- Für metagenomische Projekte, wie kann man Wirtskontamination ausschließen?
- 1) Versuchen Sie beim Entnehmen von Proben, diese nicht in der Nähe des Gewebes zu entnehmen.
2) Verwenden Sie das geeignete Kit beim Extrahieren.
3) Wenn ein Referenzgenom vorhanden ist, kann die Kontamination des Wirtsgenoms durch vergleichende Analyse entfernt werden.
- 1) Versuchen Sie beim Entnehmen von Proben, diese nicht in der Nähe des Gewebes zu entnehmen.
- Kann die Metagenom-Sequenzierung durchgeführt werden, wenn eine große Menge an Wirtskontamination vorliegt und keine Referenzsequenz des Wirtsgenoms vorhanden ist?
- Nein, wenn die Wirts-DNA eine große Menge an Umwelt-DNA enthält, wird es nach der Sequenzierung zu ernsthaften Kontaminationen kommen, und es gibt keine bekannte Wirtsgenomsequenz zum Vergleich und zur Dekontamination, was die Genauigkeit der nachfolgenden Analyse beeinträchtigen und die verfügbare Datenmenge gering halten wird; jedoch, wenn die Menge der Kontamination des Wirtsgenoms während des Extraktionsprozesses gering ist, kann die Kontamination für die spätere Datenanalyse ignoriert werden.
- Welche Gene sind von KEGG annotiert?
- Alle Gene, die durch unsere Analyse annotiert wurden, können annotiert werden, und Sie können auch die Teile auswählen, die Sie interessieren.
- Muss ich biologische Replikate für eine Metaanalyse haben?
- Es ist besser, 5 oder mehr biologische Replikate zu haben, und mehr als 10 biologische Replikate werden für menschliche und tierische Proben aufgrund ihrer individuellen Spezifität empfohlen.
Probenvorbereitung
- Was sind die Überlegungen zur Vorbereitung von metagenomischen Bodenproben?
- Bodenproben: Beim Probenahme entfernen Sie die oberste schwimmende Bodenschicht, graben Sie die Bodenschicht in einer Tiefe von 5-20 cm mit einem Ethanolfeuerlöffel aus. Nach dem Entfernen der sichtbaren Wurzeln wird der Boden durch ein 2 mm Sieb gegeben. Jede Probe wird an 3 Probenahmestellen entnommen und gemischt, wobei das Probenvolumen 5 g beträgt. Bewahren Sie die gesammelten Bodenproben in sterilen Zentrifugenröhrchen auf und lagern Sie sie unter 0℃. Nach der Probenahme transportieren Sie sie zurück ins Labor zur DNA-Extraktion und verwenden Sie sie für die DNA-Extraktion. Wenn Sie nicht sofort experimentieren können, frieren Sie die Bodenproben schnell im -20℃ Gefrierschrank ein.
- Welche Überlegungen gibt es bei der Probenvorbereitung von metagenomischen Gülleproben?
- Stuhlproben: Stuhl kann bei -80°C gelagert werden. Als Faustregel gilt, dass es am besten ist, internen Stuhl für die Genomextraktion zu entnehmen, aber es ist nicht einfach zu handhaben. Aufgrund der Besonderheiten des Stuhls selbst wird empfohlen, ihn jederzeit zu sammeln und zu lagern, um eine optimale DNA-Extraktion zu erreichen.
Nur für Forschungszwecke, nicht zur klinischen Diagnose, Behandlung oder individuellen Gesundheitsbewertung bestimmt.
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