Tse OYO, Jiang P, Cheng SH, Peng W, Shang H, Wong J, Chan SL, Poon LCY, Leung TY, Chan KCA, Chiu RWK, Lo YMD
PNAS 2. Februar 2021 118 (5) e2019768118
Zusammenfassung
5-Methylcytosin (5mC) ist eine wichtige Art der epigenetischen Modifikation. Die Bisulfid-Sequenzierung (BS-seq) hat Einschränkungen, wie zum Beispiel eine starke DNA-Zersetzung. Mit Hilfe der Einzelmolekül-Echtzeit-Sequenzierung haben wir eine Methode entwickelt, um 5mC direkt zu untersuchen. Dieser Ansatz untersuchte ganzheitlich die kinetischen Signale einer DNA-Polymerase (einschließlich Interpulse-Dauer und Pulsbreite) sowie den Sequenzkontext für jedes Nukleotid innerhalb eines Messfensters, das als ganzheitliches kinetisches (HK) Modell bezeichnet wird. Das Messfenster jedes analysierten doppelsträngigen DNA-Moleküls umfasste 21 Nukleotide mit einem Cytosin an einer CpG-Stelle in der Mitte. Wir verwendeten amplifizierte DNA (unmethyliert) und mit M.SssI behandeltes DNA (methyliert) (M.SssI ist eine CpG-Methyltransferase), um ein konvolutionales neuronales Netzwerk zu trainieren. Die Fläche unter der Kurve zur Unterscheidung der Methylierungszustände mit solchen Proben betrug bis zu 0,97. Die Sensitivität und Spezifität für die genomweite 5mC-Detektion mit einer Einzelbasenauflösung erreichten 90 % bzw. 94 %. Das HK-Modell wurde dann an menschlich-maus-hybriden Fragmenten getestet, bei denen jedes Mitglied des Hybrids einen unterschiedlichen Methylierungsstatus hatte. Das Modell wurde auch an menschlichen genomischen DNA-Molekülen getestet, die aus verschiedenen biologischen Proben wie Buffy Coat, Plazenta und Tumorgewebe extrahiert wurden. Die insgesamt durch das HK-Modell abgeleiteten Methylierungsniveaus korrelierten gut mit denen der BS-seq (r = 0,99; P < 0,0001) und ermöglichten die Messung von allelspezifischen Methylierungsmustern in imprintierten Genen. Zusammenfassend hat diese Methodik ein System für gleichzeitige genomweite genetische und epigenetische Analysen bereitgestellt.
Mehr Informationen unter: https://www.pnas.org/content/118/5/e2019768118
Nur für Forschungszwecke, nicht zur klinischen Diagnose, Behandlung oder individuellen Gesundheitsbewertung bestimmt.
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