Richtlinien zur Einreichung von Proben
Häufig gestellte Fragen
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Musterlieferung
- 1.Welches Ausgangsmaterial akzeptiert CD Genomics für die Dienstleistungen?
- Wir akzeptieren totale RNA, genomische DNA, Amplicon, Zellkulturen und Pellets, Gewebe, Blut usw.
- 2. Wir werden mehrere Proben zu verschiedenen Zeitpunkten sammeln. Sollten wir die Sequenzierung durchführen, wenn wir alle Proben gesammelt haben?
- Sie können uns Proben in mehreren Chargen senden. Dies ermöglicht es uns, zunächst die Qualitätskontrolle durchzuführen, um die Qualität der Proben zu überprüfen. Wenn eine Probe die Qualitätskontrolle nicht besteht, haben Sie etwas Zeit, um neue Proben vorzubereiten, und wir werden die Sequenzierung durchführen, sobald wir alle Proben erhalten haben.
- 3.Können Sie bevorzugte RNA/DNA-Isolationskits empfehlen, die die besten Qualitätsproben für NGS-Dienste liefern?
- Für RNA-seq wird häufiger Trizol verwendet, Sie können jedoch die Chloroform/Phenol-Methode zur Reinigung gemäß den Anweisungen im Trizol-Kit verwenden. Eine einfachere Methode ist die Verwendung des kommerziellen Kits (z. B. Qiagen RNeasy Mini Kit). Darüber hinaus empfehlen wir für die Isolierung von Gesamt-RNA aus Pflanzenproben das Qiagen RNeasy Plant Mini Kit.
Für die miRNA-Sequenzierung können Sie Ihre RNA-Probe mit einem mirVana™ miRNA-Isolationskit oder dem Kit von Qiagen isolieren. Wir bevorzugen jedoch den Erhalt einer Total-RNA-Probe, damit wir die Bioanalyzer-QC durchführen können, um die RNA-Qualität vor Beginn der Bibliothekskonstruktion zu überprüfen.
Für andere Dienstleistungen gibt es in der Regel keine bevorzugten DNA/RNA-Isolationskits, solange die Mindestanforderungen für die Qualitätskontrolle erfüllt sind.
- Für RNA-seq wird häufiger Trizol verwendet, Sie können jedoch die Chloroform/Phenol-Methode zur Reinigung gemäß den Anweisungen im Trizol-Kit verwenden. Eine einfachere Methode ist die Verwendung des kommerziellen Kits (z. B. Qiagen RNeasy Mini Kit). Darüber hinaus empfehlen wir für die Isolierung von Gesamt-RNA aus Pflanzenproben das Qiagen RNeasy Plant Mini Kit.
- 4. Wie lange bewahrt CD Genomics meine Proben auf? Schicken Sie mir die verbleibenden Proben zurück?
- Aufgrund des begrenzten Platzes im Gefrierschrank der DNA-Sequenzierungsanlage bewahren wir Ihre Proben nur für 2 Monate auf, nach denen sie ohne Vorwarnung entsorgt werden. Wenn Sie möchten, dass Ihre verbleibenden Proben zu Ihnen zurückgeschickt werden, kontaktieren Sie uns bitte, wir berechnen eine Versand- und Bearbeitungsgebühr.
- 5.Wird der Ferntransport (z.B. international) den Zustand der Probe beeinflussen?
- Durch die Verwendung geeigneter Versandmethoden wird der Transport den Zustand der Proben nicht beeinträchtigen. Bei DNA-Proben sind die meisten DNA-Proben einige Tage lang auf Eis stabil, Trockeneis ist nicht erforderlich. Bei RNA-Proben ist RNA viel weniger stabil als DNA; Sie können sie mit Trockeneis, mit Ethanol-Niederschlag oder unter Verwendung von RNAstable-Reagenz versenden. Für Gewebeproben können Sie RNAlater-Reagenzien verwenden und bei Raumtemperatur versenden.
Bitte verschließen Sie jedes Vial-Röhrchen, um Leckagen, Bruch und Verdunstung absolut zu verhindern, und ein sekundärer Behälter wird empfohlen.
- Durch die Verwendung geeigneter Versandmethoden wird der Transport den Zustand der Proben nicht beeinträchtigen. Bei DNA-Proben sind die meisten DNA-Proben einige Tage lang auf Eis stabil, Trockeneis ist nicht erforderlich. Bei RNA-Proben ist RNA viel weniger stabil als DNA; Sie können sie mit Trockeneis, mit Ethanol-Niederschlag oder unter Verwendung von RNAstable-Reagenz versenden. Für Gewebeproben können Sie RNAlater-Reagenzien verwenden und bei Raumtemperatur versenden.
- 6. Akzeptieren Sie FFPE-Proben für WES und RNA-seq?
- Ja. Für WES können wir degradiertes DNA verwenden. Für degradiertes FFPE-RNA nutzen wir die Ribo-Zero-Technologie, um rRNA zu entfernen, da das normale Protokoll aufgrund des Verlusts der Poly-A-Schwänze nicht funktioniert.
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Technologieplattform
- 1. Welche Sequenzierungsplattformen haben Sie?
- Wir haben die Illumina-Sequenzierungsplattformen und die PacBio SMRT Sequel-Sequenzierungsplattform, und wir richten die Oxford Nanopore-Plattform ein.
- 2.Wie garantieren Sie die Sequenzierungsqualität?
- Wir werden den Kunden in jedem wichtigen Schritt den QC-Bericht zur Verfügung stellen, d.h. QC der ursprünglichen Eingabemuster, QC der Bibliotheksvorbereitung und QC der Rohdaten zur Überprüfung der Sequenzierungsqualität. Dennoch stellen Sie sicher, dass Sie Ihre eigene Qualitätskontrolle durchführen, bevor Sie die Proben versenden, um Verzögerungen oder andere Probleme bei der Verarbeitung zu vermeiden.
Zur Überwachung der Sequenzierungsqualitätskontrolle wird die PhiX-Kontrolle verwendet. Die Illumina PhiX-Kontrolle kann als positiver Kontrollstandard im Clusterprozess eingesetzt werden. Wenn ein Problem bei der Probenvorbereitung auftritt, erzeugt PhiX dennoch Cluster. Diese Cluster helfen dabei zu erkennen, ob ein Mangel an Clustern auf einen Fehler in der Probenvorbereitung oder auf einen Fehler im Clustererzeugungsprozess zurückzuführen ist. Und wir werden den Sequenzierungsschritt wiederholen, wenn der Fehler auf den Sequenzierungsdurchlauf zurückzuführen ist.
- Wir werden den Kunden in jedem wichtigen Schritt den QC-Bericht zur Verfügung stellen, d.h. QC der ursprünglichen Eingabemuster, QC der Bibliotheksvorbereitung und QC der Rohdaten zur Überprüfung der Sequenzierungsqualität. Dennoch stellen Sie sicher, dass Sie Ihre eigene Qualitätskontrolle durchführen, bevor Sie die Proben versenden, um Verzögerungen oder andere Probleme bei der Verarbeitung zu vermeiden.
- 3. Welche Methoden verwenden Sie für die Qualitätskontrolle?
- Typischerweise führen wir eine Qualitätskontrolle der Proben mit dem Qubit, NanoDrop und Agarose-Gel durch, um die Menge der Probe zu bestimmen, und verwenden den Agilent Bioanalyzer (Branchennorm), um die RNA-Integritätszahl (RIN) zu ermitteln.
Die Qualitätskontrolle der Bibliothek wird ebenfalls mit dem Agilent Bioanalyzer durchgeführt, um die Größe und Reinheit der Bibliothek zu bestimmen. Außerdem führen wir vor dem Laden der Bibliotheken auf den Sequenzierer eine qPCR-Quantifizierung durch. Die Kosten dafür sind im Sequenzierungsdienst enthalten.
Für die Qualitätskontrolle der endgültigen Daten, die aus unserem Sequenzierungsdienst generiert werden, wird die integrierte Software in der Regel die Aufgabe übernehmen und ausreichende QC-Informationen bereitstellen. Auf Anfrage können wir jedoch auch zusätzliche QC-Daten wie FASTQC zur Verfügung stellen.
- Typischerweise führen wir eine Qualitätskontrolle der Proben mit dem Qubit, NanoDrop und Agarose-Gel durch, um die Menge der Probe zu bestimmen, und verwenden den Agilent Bioanalyzer (Branchennorm), um die RNA-Integritätszahl (RIN) zu ermitteln.
- 4. Wie viele biologische Replikate benötige ich für jede Bedingung?
- Um das Vertrauen zu erhöhen und experimentelle Fehler zu reduzieren, wird dringend empfohlen, für jede Behandlung/Jedere Gruppe mindestens 3 Replikate einzureichen. Bitte beachten Sie, dass dies lediglich als Richtlinie dient und die endgültige Anzahl der Replikate und Proben vom Endbenutzer basierend auf seinen endgültigen experimentellen Bedingungen festgelegt wird. Wir erstellen keine technischen Replikatbibliotheken aus derselben Probe, da die Technologie der Next-Generation-Sequenzierung selbst hoch reproduzierbar ist.
- 5. Kombinieren Sie Proben/Bibliotheken in einem Sequenzierungslane?
- Ja, wir können Ihre Proben multiplexen und die durchschnittlichen Sequenzierungskosten für jede Probe senken.
- 6. Wenn wir nicht genügend Ausgangsmaterial haben, wie Sie vorschlagen, können Sie dann trotzdem fortfahren?
- Wir können die Strategie zur Vorbereitung von DNA/RNA-Bibliotheken mit niedrigem Input anwenden. Alternativ können wir auch eine Option für die Amplifikation von DNA/RNA anbieten, gefolgt von der Bibliotheksvorbereitung.
- 7. Akzeptieren Sie selbst erstellte Bibliotheken?
- Ja, und wir werden einen Bioanalyzer zur Qualifizierung durchführen, bevor wir in den Sequencer laden. Wir benötigen mindestens eine 10 nM gepoolte Bibliothek.
- 8. Welche Technologie verwenden Sie für SNP-Genotypisierung?
- Wir bieten SNP-Genotypisierungsdienste sowohl im gesamten Genommaßstab als auch an gezielten Loci an.
Für die SNP-Genotypisierung des gesamten Genoms bieten wir die gesamte Genomsequenzierung unter Verwendung von Next-Generation-Sequencing-Technologie an, und wir bieten auch SNP-Mikroarrays unter Verwendung kommerzieller Arrays an.
Für die gezielte Genotypisierung von Loci können wir mehrere Technologien verwenden, darunter MassARRAY SNP-Genotypisierung, SNaPshot und KASP-Technologie unter Verwendung von Next-Generation-Sequencing. Wir bieten kostenlose Beratung an, um geeignete Ansätze für Ihr angefordertes Projekt zu entwerfen.
- Wir bieten SNP-Genotypisierungsdienste sowohl im gesamten Genommaßstab als auch an gezielten Loci an.
- 9. Welche Vorteile hat RNA-Seq im Vergleich zur Verwendung von Genexpressionsprofiling-Mikroarrays?
- Im Vergleich zu mikroarray-basierten Methoden bietet RNA-Seq eine deutlich höhere Abdeckung und eine bessere Auflösung der dynamischen Natur des Transkriptoms, was kosteneffektiver ist. Wir verfügen über die hochmoderne Illumina-Plattform mit der PE150-Sequenzierungsstrategie (im Durchschnitt 6 Gb Daten pro Probe) und einer starken Datenanalysefähigkeit, um Ihre Forschung zu unterstützen.
- 10. Wann ist es notwendig, rRNA aus meinen Proben vor der Sequenzierung zu entfernen, und welchen Vorteil hat das?
- In totalem RNA macht rRNA mehr als 90 % aus. Die Durchführung von RNA-Seq ohne Poly(A)-Anreicherung oder rRNA-Depletion führt dazu, dass die meisten Reads von ribosomaler RNA stammen. Daher ist Poly(A)-Anreicherung oder rRNA-Depletion für jede Sequenzierungsplattform notwendig.
- 11.Müssen wir eine miRNA-Isolierung für die miRNA-Sequenzierung durchführen?
- Es ist nicht notwendig, miRNA zu reinigen, da das NEBNext Small RNA Library Prep Kit Gesamt-RNA als Ausgangsmaterial verwendet. Dieses Kit verwendet spezielle 3'- und 5'-Adapter, die spezifisch an miRNAs und nicht an rRNA oder anderen Transkripten ligieren. VERWENDEN SIE NICHT das Säulenkits, das möglicherweise die kleine RNA herausfiltert.
- 12.Was passiert, wenn die Sequenzierung fehlschlägt?
- Zunächst führen wir in jedem wichtigen Schritt eine Qualitätskontrolle durch, um den Erfolg des Projekts sicherzustellen. Die Sequenzierung kann jedoch aus verschiedenen Gründen fehlschlagen, einschließlich Fehlern unsererseits, z. B. Instrumentenfehler, Technikerfehler, und Fehlern des Kunden, z. B. unreine Proben, falsch gestaltete Experimente. Wir werden nach besten Kräften beurteilen, ob eine fehlgeschlagene Analyse auf einen Fehler unsererseits zurückzuführen ist, und in solchen Fällen die Analyse auf unsere Kosten wiederholen. Wir übernehmen keine Haftung für Sequenzierungsfehler, die aufgrund von Fehlern oder Problemen im Labor des Kunden entstehen.
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Analysebericht
- 1.Wie erhalte ich die Rohdaten?
- Rohdaten und analysierte Ergebnisse können über ein sicheres, passwortgeschütztes FTP übertragen werden.
- Welche spezielle Software wird benötigt, um die Datenberichtsdateien anzuzeigen?
- Zunächst müssen Sie die fastq.gz-Dateien mit WinRAR entpacken, um sie mit vim, nano, gedit oder Notepad++ anzeigen zu können. Nextgen Workbench kann die Daten in der Regel sofort anzeigen, ohne sie zu entpacken. Die entpackten Daten können als Text in den Datentab von Excel importiert werden.
- 3.Welche Art von Daten liefern Sie?
- Die rohen NGS-Daten, die wir geliefert haben, werden saubere Fastq-Dateien sein. Außerdem senden wir einen Bericht für Ihr Projekt. Wenn Sie unseren bioinformatischen Analyse-Service auswählen, werden zusätzliche Dateien wie Bam-Dateien, VCF-Dateien und mehr (je nach Analyse) geliefert.
- 4. Wie lange werden meine Projektdaten gespeichert?
- Wir speichern Ihre Daten 3 Monate nach der Datenerzeugung ohne zusätzliche Kosten. Sie können uns bitten, sie länger aufzubewahren (gegen Gebühr).
- 5.Sollte ich ein Referenzgenom für die Datenanalyse bereitstellen?
- Neben der Neuanordnung vieler Anwendungen wie der Transkriptom-Sequenzierung basieren sie auf einem hochqualitativen Referenzgenom als Grundlage für die tiefere Analyse. Die vollständige Referenzsequenz gewährleistet, wo gezählt werden soll, während die vollständige Referenzannotation sicherstellt, was gezählt werden soll. Zusätzliche Annotationen eines Referenzgenoms ermöglichen tiefere Analysen wie die Analyse von Signalwegen und die Erkennung alternativer Transkripte.
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Zeitplan
- 1. Wie lange dauert es, bis Sie Ihre NGS-Dienste bereitstellen?
- Die Bearbeitungszeit hängt von der Anzahl der zu testenden Proben, der Art des Laufs, den Anforderungen an die Nukleinsäureextraktion und die Datenanalyse sowie anderen Faktoren ab. In der Regel beträgt der Zeitrahmen für den Bibliotheksaufbau und die Sequenzierung etwa 30 Werktage. Wenn wir ein Projekt mit Ihnen einrichten, werden wir Ihnen eine Schätzung geben, wie lange wir erwarten, dass es dauert.
- 2. Wie lange ist in der Regel die Gültigkeitsdauer eines Angebots?
- Die Gültigkeit des Angebots beträgt 60 Tage.
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Datenschutzsicherheit
- 1. Besitze ich das geistige Eigentum an meinen Ergebnissen? Und wie können Sie die Sicherheit unserer Daten gewährleisten?
- Ja, wir sind ein Dienstleister und beanspruchen daher kein geistiges Eigentum. Wir werden alle Daten vertraulich behandeln und versprechen, die Daten ohne Ihre Erlaubnis nicht an Dritte weiterzugeben.
Nur für Forschungszwecke, nicht zur klinischen Diagnose, Behandlung oder individuellen Gesundheitsbewertung bestimmt.
