Was ist CUT&RUN-Sequenzierung und wie vergleicht sie sich mit CUT&Tag?

Derzeit steht die epigenetische Forschung vor neuen Herausforderungen wie der Einzelzellauflösung, der Verfolgung dynamischer Prozesse und der Kompatibilität mit klinischen Proben. Zum Beispiel hängt die dynamische Verteilung von Heterochromatinmarkern während der embryonalen Entwicklung von den hochauflösenden Eigenschaften von CUT&RUN ab, während die geringen Mengen in klinischen Biopsieproben besser zu dem Vorteil der niedrigen Ausgangsmengen passen. CUT&Tag. Dieser Artikel zielt darauf ab, die technischen Prinzipien, grundlegenden Unterschiede und anwendbaren Szenarien von CUT&RUN und CUT&Tag systematisch zu überprüfen, um Forschern eine Referenz zur Auswahl geeigneter Methoden basierend auf dem Zielproteintyp, dem Chromatinzustand und den experimentellen Bedürfnissen zu bieten und die epigenetische Forschung in Richtung höherer Präzision und breiterer Anwendbarkeit zu fördern.

Vergleich von Prinzipien und Technologien

CUT&RUN-Sequenzierung: Prinzipien und Merkmale

CUT&RUN (Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease) ist eine antikörpergezielte Chromatin-Analysetechnik. Sie nutzt mikrokokkalische Nuclease (MNase), um DNA in der Nähe der Bindungsstelle des Zielproteins zu spalten und das Fragment direkt zur Sequenzierung freizusetzen.

• Die wichtigsten Schritte umfassen:
  • Zellfixierung und Permeabilisierung: Lebende Zellen werden mit Concanavalin A (ConA) Magnetperlen gebunden, und die Permeabilisierung der Zellmembran erfolgt mit Digitonin, wodurch die Notwendigkeit einer Formaldehyd-Quervernetzung entfällt.
  • Antikörperinkubation: Spezifische Antikörper zielen auf das Zielprotein (wie Histonmodifizierer oder Transkriptionsfaktoren) ab und werden durch das pA-MNase-Enzym, ein Protein A/G-Fusionsenzym, an die Chromatinbindungsstelle rekrutiert.
  • MNase-Spaltung: Nach der Ca²⁺-Aktivierung spaltet MNase die DNA, die das Zielprotein umgibt, und setzt ein Fragment von etwa 300-500 bp frei, das in den extranukleären Bereich diffundiert.
  • DNA-Reinigung und Bibliothekskonstruktion: DNA wird direkt gereinigt, endrepariert, mit A-Enden versehen und mit Sequenzierungsadaptern ligiert, ohne dass der Schritt der Sonikationszerstörung in traditionellen Verfahren erforderlich ist. ChIP.
• Vorteile:
  • Hohe Auflösung: Die Lokalisierung der Bindungsstelle ist genau auf ±50 bp, was sie besonders geeignet für die Forschung zu Pionier-Transkriptionsfaktoren (wie CTCF) macht.
  • Heterochromatin-Eignung: MNase-Enzyme haben ein kleines Molekulargewicht und können effizient eng gepackte Heterochromatinregionen (wie H3K9me3-Modifikationsstellen) spalten, was sie für komplexe Szenarien wie die embryonale Entwicklung geeignet macht.
  • Niedriges Hintergrundrauschen: Beseitigt die Notwendigkeit einer Sonikationsstörung und reduziert die Interferenz durch zufällige DNA-Brüche.

Gesamtleistung von "CUT&RUN auf Platte" (Miura M et al., 2020)

CUT&Tag: Technologische Innovation und vereinfachter Prozess

CUT&Tag (Cleavage Under Targets and Tagmentation) ist eine Verbesserung von CUT&RUN, bei der das Fusionsprotein pA-Tn5 Transposase verwendet wird, um gleichzeitig die DNA-Spaltung und die Hinzufügung von Sequenzierungsadaptern durchzuführen, was die experimentellen Verfahren erheblich vereinfacht.

• Der Arbeitsablauf umfasst:
  • Antikörperinkubation: Zellen werden mit Concanavalin A-Magnetperlen immobilisiert, und Antikörper zielen auf das Zielprotein ab und binden daran.
  • Tn5-Transposition: Nach der Aktivierung der Transposase wird die DNA direkt an der Zielstelle geschnitten und Sequenzierungsadapter werden eingefügt.
  • Bibliotheksamplifikation: Es sind keine Endreparaturen erforderlich; Sequenzierungsbibliotheken werden direkt durch PCR-Amplifikation erzeugt.
• Vorteile:
  • Einfache Bedienung: Beseitigt Quervernetzung und Sonikation, wodurch der experimentelle Zyklus auf 1 Tag verkürzt wird.
  • Niedriges Startvolumen: Es werden nur 500-50.000 Zellen benötigt, und sogar die Einzelzell-Analyse wird unterstützt.
  • Hohe Signal-Rausch-Verhältnis: Zielgerichtete Spaltung reduziert das unspezifische Hintergrundrauschen, was zu einer Datenvaliditätsrate von über 80 % führt.

Technische Unterschiede zwischen CUT&RUN und CUT&Tag

Analyse der wichtigsten Unterschiede

• Durchdringung der Kernmembran und Chromatinzustand:
  • CUT&RUN fixiert lebende Zellen mithilfe von ConA-Magnetperlen, und MNase schneidet nur die Bindungsstellen des Zielproteins, was eine starke Durchdringung in Heterochromatin (z. B. H3K9me3) ermöglicht.
  • CUT&Tag basiert auf der Tn5-Transposase, die offenes Chromatin bevorzugt und möglicherweise eine unzureichende Abdeckung von Heterochromatin aufweist, was potenziell zu falsch-negativen Ergebnissen führen kann.
• Hintergrundgeräuschkontrolle:
  • CUT&RUN verwendet präzise MNase-Spaltung, die nur DNA von Zielstandorten freisetzt und zu sehr niedrigen Hintergrundsignalen führt.
  • CUT&Tag's Tn5-Transposase kann Nicht-Zielregionen schneiden, was eine Optimierung der Antikörper und Reaktionsbedingungen erfordert, um das Rauschen zu reduzieren.

Wesentliche Unterschiede: Anwendungsbereiche und Einschränkungen

(1) Nachweis von Heterochromatin-Histonmodifikationen

• CUT&RUN ist überlegen: MNase kann Heterochromatinregionen spalten, während das Tn5-Enzym in CUT&Tag aufgrund sterischer Hinderung schwer effektiv in geschlossenen Chromatin spalten kann. Zum Beispiel zeigt die Forschung von Ruimin Xu et al., dass die dynamische Verteilung von H3K9me3 in der menschlichen embryonalen Entwicklung von CUT&RUN abhängt.

• Einschränkungen von CUT&Tag: Das Tn5-Enzym bevorzugt offene Chromatinregionen, was zu unzureichender Abdeckung von Heterochromatin führen kann, was möglicherweise zu falsch-negativen Ergebnissen führt.

Schematische Darstellung der Probenvorbereitung und CUT&RUN von Histonmodifikationen in menschlichen Präimplantationsembryonen (Xu R et al., 2022)

(2) Auflösung von Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen

• CUT&RUN hat eine höhere Auflösung: MNase-Spaltung erzeugt kürzere DNA-Fragmente mit klareren Grenzen der Bindungsstellen, was es besonders geeignet für die Untersuchung von Pioniertranskriptionsfaktoren macht. Zum Beispiel ist die Anreicherungs-Effizienz von CUT&RUN-qPCR zehnmal höher als die von traditioneller ChIP-qPCR.

• Anwendbarkeit von CUT&Tag: Es funktioniert gut für die meisten Transkriptionsfaktoren (wie RNA-Polymerase II), aber die Auflösung ist relativ niedrig (ungefähr 200-500 bp).

(3) Experimentelle Komplexität und Kosten

• CUT&Tag ist einfacher: Es sind keine Bibliotheksvorbereitungs- und Reparaturschritte erforderlich, was es für die Hochdurchsatzprobenverarbeitung geeignet macht.

• CUT&RUN ist etwas teurer: Eine zusätzliche Optimierung der MNase-Aktivität und der Adapterligatur ist erforderlich, aber die Datenqualität ist stabiler.

Empfehlungen

Szenarien, in denen CUT&RUN bevorzugt wird

Eine hochauflösende Lokalisierung von Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren ist erforderlich.

Zum Beispiel verwendeten Miura M et al. die CUT&RUN-Technologie, um die Chromatinbindungsmerkmale der RNA-Polymerase II (Pol II) in der menschlichen Lungenkrebszelllinie A549 zu analysieren, und enthüllten die einzigartige biologische Bedeutung von zwei unterschiedlichen Bindungsstrukturen von Pol II in der Nähe des Transkriptionsstartpunkts (TSS) und kurzer DNA-Fußabdrücke. Die wichtigsten Ergebnisse sind wie folgt: Mit CUT&RUN (Zielgerichtete Mikrokokken-Nuklease-DNA-Spaltungs-Erkennungsprotein-Fußabdrücke) als Werkzeug wurde die Verteilung von Pol II in A549-Zellen analysiert:

• Lange Fragmente (>270 bp): Entsprechend einer bimodalen Verteilung um den TSS (ähnlich den klassischen ChIP-Ergebnissen), die pausiertes Pol II repräsentiert (Bindung an Komplexe wie NELF und Festhalten nach der Transkriptionsinitiierung);

• Kurze Fragmente (< 120 bp): Sie machen etwa 5 % der gesamten Reads aus, aber ein klarer Peak kann am TSS identifiziert werden – dies ist eine transiente Lokalisation von Pol II vor der Pause nahe dem Promotor (nicht durch konventionelles ChIP nachgewiesen). Einige kurze Fragmente könnten auch "abrupte Initiierung" entsprechen (Pol II wird vom Startpunkt freigesetzt, kann aber die Transkription nicht verlängern).

• Bedeutung

• Die einzigartigen Fußabdrücke kurzer Fragmente (< 120 bp) zeigen die vorübergehende Lokalisation von Pol II in der Nähe des Promotors und ergänzen die blinden Flecken der klassischen ChIP;

• Die Lage großer Fußabdrücke (langer Fragmente) korreliert mit der transkriptionalen Richtung, was den funktionalen Wert verschiedener CUT&RUN-Fußabdrücke verdeutlicht.

Arbeitshypothese zu den Pol II-Fußabdrücken und der Pol II-Pause (Miura M et al., 2020)

Analyse von Heterochromatinmarkern

Zum Beispiel verwendeten Yang H et al. CUT&RUN, um Histonmodifikationen im gesamten Genom zu lokalisieren, und fanden heraus, dass ein Mangel an Brd4 zu einem globalen Anstieg der Anreicherungsniveaus von zwei aktiven Chromatinmarkern (H3K122ac: aktiv mit Transkription verbunden; H3K4me3: aktiver Promotormarker) in HSCs/HPCs führte. Diese Veränderung fiel mit der Hochregulation der altersbezogenen Genexpression zusammen. Dieses Ergebnis offenbart den Mechanismus, durch den Brd4 die Funktion von HSC/HPC aufrechterhält und das Altern verhindert, indem es Histonmodifikationen reguliert (die Überanreicherung von H3K122ac/H3K4me3 hemmt).

Priorisierte Szenarien für CUT&Tag

Begrenzte Stichprobengröße oder erforderliche schnelle experimentelle Zyklen

Zum Beispiel verwendeten Wu SJ et al. die scCUT&Tag-Technologie, um die Einzelzell-Chromatinlandschaft spezifischer Histonmodifikationen (H3K27me3) zu analysieren.

• Zelltypdifferenzierung und PcG-Landschaftsgenerierung: scCUT&Tag-Analyse von H3K27me3 kann menschliche Blutzelltypen unterscheiden und erzeugt zelltyp-spezifische PcG-Landschaften aus heterogenen Geweben.

• Analyse der Tumorheterogenität:
  • Die Analyse von H3K27me3 bei Gehirntumorpatienten vor und nach der Behandlung (einschließlich rezidivierter Proben) identifizierte Zelltypen und Heterogenität der PcG-Aktivität in der Tumormikroumgebung;
  • In rezidivierten Proben wurden vier Zelltypen identifiziert, die eine Anreicherung des T1-Clusters zeigten (ähnlich dem T1-Cluster in primären Tumoren). In den medikamentenresistenten Zellclustern wurde das preneuronale Genom (Verhaak_glioblastoma_proneural) stillgelegt, und die PcG-Landschaft näherte sich einem stamzellähnlichen Zustand (nicht-terminal differenziert).

Studien zu Histonmodifikationen in offenen Chromatinregionen

Zum Beispiel verwendeten Xie B et al. die CUT&Tag-Technologie, um die regulatorische Rolle der Histon H3K18-Lactylierung (H3K18la) bei Blasenkrebs zu untersuchen und fanden heraus, dass:

• H3K18la ist in den Promotorregionen zahlreicher Gene angereichert;

• CUT&Tag-Sequenzierung zeigte, dass H3K18la-verwandte Gene reich an mehreren Signalwegen sind, die die Tumorigenese regulieren, was darauf hindeutet, dass H3K18la eine entscheidende Rolle im Fortschreiten von menschlichem Blasenkrebs spielt.

• Die Promotorregion von LCN2 ist angereichert mit H3K18la;

• Glykolyse-Inhibitoren oder die Überexpression von circXRN2 können die Interaktion zwischen H3K18la und dem LCN2-Promotor verringern, was die Schlüsselregulatorrolle von H3K18la in der LCN2-Transkription bestätigt (bestätigt durch nachfolgende ChIP-Experimente).

Zusammenfassung

Sowohl CUT&RUN als auch CUT&Tag haben die Paradigmen der Chromatinforschung revolutioniert, aber jede Methode hat ihren eigenen Schwerpunkt:

• CUT&RUN: Hervorragend in hoher Auflösung und Heterochromatin-Kompatibilität, was es zum "Goldstandard" für komplexe epigenetische Studien macht.

• CUT&Tag: Zu den Vorteilen gehören die Benutzerfreundlichkeit und die geringen Anfangsmengen, was es zum bevorzugten Werkzeug für die routinemäßige Analyse von Histonmodifikationen macht.

Die beiden sind komplementär und nicht austauschbar; Forscher sollten flexibel wählen, basierend auf dem Typ des Zielproteins, den Eigenschaften der Probe und den experimentellen Anforderungen.

Die Leute fragen auch

Was ist der Unterschied zwischen CUT&RUN und CUT&Tag?

CUT&RUN verwendet Ca2+-aktivierte pAG-MNase, um die DNA zu spalten, während CUT&Tag Mg2+-aktivierte pAG-Tn5 verwendet, um die DNA zu spalten.

Was ist CUT&RUN-Sequenzierung?

CUT&RUN ist eine antikörpergezielte Chromatin-Profilierungstechnik, die DNA in situ innerhalb permeabilisierter Zellkerne schneidet und eine hochauflösende Kartierung von Protein-DNA-Interaktionen mit geringem Hintergrund und minimalem Zellinput ermöglicht.

Was sind die Vorteile von CUT&RUN gegenüber ChIP-seq?

CUT&RUN bietet entscheidende Vorteile gegenüber ChIP-seq, einschließlich geringerer Hintergrundgeräusche, höherer Auflösung, schnellerem Protokoll und erheblich reduzierten Zellinput-Anforderungen.

Was ist der Unterschied zwischen CUT&Tag und ATAC-Seq?

ATAC-Seq ermöglicht es Forschern, die Standorte von offener Chromatin, Nucleosomen und besetzten Transkriptionsfaktoren mithilfe von adapterbeladenem Tn5 zu erkennen. CUT&Tag zeigt Protein-Chromatin-Interaktionen unter Verwendung eines Zielantikörpers und adapterbeladenem pA-Tn5 auf.

Referenzen

1. Miura M, Chen H. CUT&RUN erkennt distincte DNA-Fußabdrücke von RNA-Polymerase II in der Nähe der Transkriptionsstartstellen.. Chromosomenforschung. Dezember 2020;28(3-4):381-393.
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