Forschung zu seltenen Krankheiten mit Whole Exome Sequencing

Seltene Krankheiten sind solche mit extrem niedrigen Inzidenzraten. Weltweit gibt es etwa 7.000 seltene Krankheiten, von denen viele genetisch bedingt sind. Die Forschung an diesen Krankheiten steht vor erheblichen Herausforderungen aufgrund ihrer vielfältigen Symptome, komplexen pathogenetischen Mechanismen und des Mangels an wirksamen Behandlungen. In den letzten Jahren, Whole-Exom-Sequenzierung (WES), eine Hochdurchsatz-Genomsequenzierungstechnologie, ist zu einem wichtigen Werkzeug in der Forschung zu seltenen Krankheiten geworden. Dieser Artikel wird die Anwendungen und Vorteile der Whole-Exome-Sequenzierung in der Forschung zu seltenen Krankheiten untersuchen.

I. Technischer Hintergrund und zentrale Vorteile

WES identifiziert schnell pathogene Mutationen, indem etwa 1 % der Exonregionen (DNA-Fragmente, die Proteine kodieren) im Genom mit Hilfe von Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie angesteuert werden. Im Vergleich zu Whole-Genome-Sequenzierung (WGS), WES ist kostengünstiger (ungefähr 1/10 der Kosten von WGS), bietet eine effizientere Datenanalyse und deckt über 85 % der bekannten pathogenen Mutationen ab. Zu seinen Hauptvorteilen gehören:

• Hochgradig effiziente Lokalisierung von pathogenen Genen: Durch den Vergleich von Exonvariationen zwischen Patienten und gesunden Individuen, kombiniert mit bioinformatischen Filtern (wie dem Ausschluss häufiger Variationen und der Suche nach funktionell schädlichen Mutationen), können Gene, die mit seltenen Krankheiten assoziiert sind, schnell identifiziert werden. Zum Beispiel wurde das pathogene Gen DHODH für das Miller-Syndrom bei vier Patienten mittels WES entdeckt.
• Geeignet für Studien mit kleinen Stichproben: Die traditionelle Verknüpfungsanalyse erfordert eine große Anzahl von Familienstichproben, während WES nur wenige Patienten benötigt, um neue pathogene Gene zu entdecken, was die Forschungsschwelle erheblich senkt.
• Unterstützung für multidimensionale Analysen: Die Kombination von Transkriptom- und Epigenomdaten kann komplexe regulatorische Mechanismen aufdecken (wie den Einfluss von Variationen in nicht-kodierenden Regionen auf das Spleißen).

II. Klinische Anwendungsfälle

Fall 1: WES-Analyse von 58 kritisch kranken Kindern

1. Kerntechnologie: Kombinierte Erkennung von CNVs und SNVs

WES erkennt nicht nur SNVs, sondern identifiziert auch CNVs mithilfe von bioinformatischen Werkzeugen und erreicht so eine umfassende Erfassung pathogener Varianten bei seltenen Krankheiten.

• CNV-Erkennung: WES identifizierte zwei neuartige pathogene CNVs (7q36.3 Deletion + 18q12.1q23 Duplikation bei Patient P9 und 20q13.13 Deletion bei Patient P10). Die CMA-Validierung bestätigte die Beteiligung von ClinGen-Haploinsuffizienzgenen (wie SHH und ADNP), die Phänotypen wie Mikrognathie, Entwicklungsverzögerung und Hypertelorismus erklären, von denen keiner zuvor berichtet worden war.
• SNV-Erkennung: Pathogene/probable pathogene (P/LP) SNVs wurden bei 25 von 58 Patienten (43,1 %) gefunden, die 24 Gene betreffen (einschließlich 23 neuartiger SNVs), darunter compound heterozygote (11 Fälle), homozygote (2 Fälle) und X-chromosomale rezessive Varianten (1 Fall). Zum Beispiel:
  • ACAT1-Gen komplexe heterozygote Varianten (P14/P15) verursachen schwere metabolische Azidose;
  • Heterozygote Varianten des COG4-Gengenkomplexes (P21) verursachen eine kongenitale Glykosylierungsstörung (Typ IIj);
  • Pathogene Varianten des TOR1A-Gens (P8) sind mit Hirntumoren und Atemversagen assoziiert.

2. Diagnostische Ergebnisse: Verbesserung der Diagnoserate und phänotypische Erweiterung seltener Krankheiten

• Gesamtdiagnoserate: Von 58 Patienten hatten 27 (56,9%) genetische Befunde, und 25 (43,1%) erhielten eine definitive genetische Diagnose, wobei die kumulative Diagnoserate deutlich höher war als bei traditionellen Methoden.
• Phänotypische Erklärungsfähigkeit: Bei 72,7 % der Patienten mit genetischen Befunden (24/33) konnte der Genotyp das Hauptphänotyp erklären (z. B. erklärt die COG4-Variante in P21 Gelbsucht und Epilepsie; die ACAT1-Variante in P15 erklärt die metabolische Azidose), während nur 6 Fälle (18,2 %) Phänotypen aufwiesen, die teilweise durch den Genotyp erklärt wurden (hauptsächlich überlagert mit schweren Infektionen).
• Krankheitsverteilung: Bezieht sich auf seltene Krankheiten in mehreren Systemen, einschließlich Stoffwechselstörungen (ACAT1, PNPO), neurodevelopmentale Störungen (COG4, WDR73), Immunmangel (SH3KBP1) und Skelettanomalien (IQCE). Schwere Infektionen (Pneumonie, Sepsis, Gehirninfektion) sind häufige Begleitsymptome (70,4 % der Patienten mit genetischen Erkrankungen haben gleichzeitig Infektionen, mit einer Sterblichkeitsrate von 68,4 %).

3. Kernwert: Komplexe Genotypanalyse und Neuentdeckung von Genen

• Komplexe Genotypidentifikation: WES korrigiert Fehlurteile in der traditionellen SNV-Analyse. Zum Beispiel wurde bei Patient P8, basierend auf einer großen Deletion des X-Chromosoms (die fast den p/q-Arm erstreckt) und der SNV-Analyse, angenommen, dass er das Turner-Syndrom (45,X) hat, und eine pathogene TOR1A-Variante wurde entdeckt. Elf Patienten mit AR-Gen wurden durch die Analyse der komplexen Heterozygotie von CNV+SNV als pseudohomozygot identifiziert (z.B. PNPO-Gen SNV+Duplikation, die zu Epilepsie führt).
• Neue Varianten und phänotypische Erweiterung: Es wurden 23 neuartige SNVs (15 Gene) und 2 neuartige CNVs entdeckt, die die Gen-Phänotyp-Assoziationen für 19 seltene Krankheiten erweitern. Zum Beispiel:
  • Die Duplikation des SH3KBP1-Gens (P9) deutet auf einen Zusammenhang zwischen der X-chromosomalen Immunodefizienz-61 und neurodevelopmentalen Anomalien hin;
  • Die Deletion des Chromosoms 4 (P11) unterstützt die Rolle der Region 4p14-p13 in der Neuroentwicklung (Liu J et al., 2021).

Flussdiagramm der Patientenauswahl und genetischen Befunde in der Studie (Liu J et al., 2021)

Fall 2: Anwendung von WES bei Hypophosphatasie

(1) Diagnose und Klassifikation von HPP

Direkte Detektion von ALPL-Genvariationen: Bei drei Patienten (Fall 1, 2 und 3) bestätigte WES heterozygote ALPL-Genvariationen (z. B. c.1447G>A/p.Val483Met, c.205G>A), die entdeckt wurden durch Sanger-SequenzierungKombiniert mit Phänotypen wie niedriger TNSALP-Aktivität (TSALP) und Skelettdeformationen wurde HPP (infantile oder milde Form) diagnostiziert.

(2) Identifizierung komplexer genetischer Erkrankungen

• Entdeckung von Cosegregierenden Variationen: Im Fall 1 entdeckte die WES eine heterozygote Variation des SMC1A-Gens (c.3470del) basierend auf ALPL-Variationen, die die überlappenden Phänotypen des Patienten wie Epilepsie und Entwicklungsverzögerung erklärte (HPP und Entwicklungs-Epilepsie 85 cosegregiert); im Fall 2 entdeckte die WES eine homozygote Variation des WNT10A-Gens (c.682T>A), was auf eine potenzielle Assoziation zwischen ekto-dermalen Entwicklungsanomalien und dem HPP-Phänotyp hindeutet.
• Korrektur einer Fehldiagnose eines einzelnen Gens: Im Fall 6 wurde zunächst der Verdacht auf HPP (niedriger TSALP) geäußert. WES fand keine ALPL-Varianten, entdeckte jedoch eine homozygote Variante des SLC5A1-Gens (c.1946G>A), die eine Glukose-Galaktose-Malabsorption (GGM) bestätigte. Die Symptome verbesserten sich durch diätetische Intervention (Entfernung von Laktose/Glukose/Saccharose), wodurch eine ineffektive Behandlung für HPP vermieden wurde.

Differentialdiagnose bei Abwesenheit von ALPL-Varianten

• Wenden wir uns anderen pathogenen Genen zu: In Fall 4 (keine ALPL-Variante nachgewiesen) fand die WES heterozygote Varianten (VUS) der Gene TRIO (c.5651A>C) und TRPV4 (c.880T>G), was auf einen möglichen Zusammenhang zwischen Neuroentwicklung und abnormalem Knochenstoffwechsel hindeutet; in Fall 5 wurden Varianten des TTN-Gens (c.32078-1G>T, c.47720_47721del) nachgewiesen, die auf die Myopathie von Salih (angeborene Myopathie Typ 5) hinweisen.
• Klinischer Wert negativer Ergebnisse: In Fall 7 konnte WES keine ALPL- und andere Genvariationen nachweisen. In Kombination mit einer eingehenden phänotypischen Analyse (Gesichtsmerkmale, intrauterine Vorgeschichte) wurde die Diagnose eines fetalen Alkoholsyndroms bestätigt, was die nicht-erblichen Ursachen klärte und Übertests vermied (Glotov OS et al., 2024).

Zeitabhängige Dynamik der Fluktuationen von Aminosäureresten für Wildtyp- und Phe228Ile-mutierte WNT10A-Proteine (Glotov OS et al., 2024)

Anwendungen der Whole Exome Sequenzierung (WES) bei extrem seltenen erblichen Nierenerkrankungen

1. Überwindung der Einschränkungen der Genpanelanalyse zur Erkennung extrem seltener Krankheiten

Gezielte Genpanels decken nur 20-100 bekannte erbliche Nierenerkrankungs-Gene ab, während WES das gesamte Exon abdeckt und die Erkennung von extrem seltenen Krankheiten ermöglicht, die nicht in den Panels enthalten sind (wie das renale Syndrom in den Familien 5-7 und 9, infantile Hyperkalzämie Typ 1 usw.), wodurch lange Diagnosetzeiten und Kosten aufgrund von Panel-Auslassungen vermieden werden.

2. Identifizierung unerwarteter pathogener Varianten und Validierung der "Genotyp-Phänotyp"-Assoziation

WES hat unerwartete Krankheiten diagnostiziert (wie das Ayme-Gripp-Syndrom, das durch die MAF-Mutation in Familie 3 verursacht wird, und die kurzgerippte thorakale Dysplasie Typ 9, die durch die IFT140-Mutation in Familie 4 verursacht wird). Durch das Genotyp-Phänotyp-Paradigma von "klinischen Informationen + Genomsequenzierung" wird die volle Verantwortung der Variante für den Phänotyp verifiziert (z. B. erklärt die MAF-Mutation Gesichtsdeformitäten, Hörverlust und Nierenbeteiligung; die IFT140-Mutation erklärt die Skelettdysplasie und das früh einsetzende ESRD).

3. Leitende Präzisionsintervention und prognostische Vorhersage

• Pathophysiologische Interpretation: Zum Beispiel zeigt in Familie 2 der APRT-Mangel (homozygote Nonsense-Variante) eindeutig eine übermäßige Produktion von 2,8-Dihydroxyadenin, die zu Nierensteinen führt und Xanthinoxidase-Hemmer sowie eine urea-restriktive Diät erforderlich macht;
• Behandlungsanpassung: In Familie 8 verursacht die heterozygote Mutation im TRPM6-Komplex Hypomagnesiämie, was eine Anpassung der Calcium- und Magnesiumsupplementierung erfordert (Absetzen von Calcium und Erhöhung von Magnesium);
• Transplantationsentscheidung: In Familie 1 wird bei ADTKD-UMOD (UMOD-Missense-Variante) eine Nierentransplantation von einem nicht betroffenen Nachkommen ausgewählt;
• Prognostische Überwachung: In Familie 4 erfordert SRTD 9 (IFT140-Variante) eine regelmäßige Überwachung der Leberfunktion, des Knochenwachstums und der Netzhautablösung.

Basierend auf der Ganzexom-Sequenzierung und der Pathogenität wurden die Genealogien von neun Familien präsentiert (Jung J et al., 2021).

III. Technische Herausforderungen und Lösungen

Datenanalyse-Komplexität

• Herausforderung: WES-Daten erfordern die Verarbeitung von Millionen von Varianten, was es schwierig macht, zwischen pathogenen und benignen Varianten zu unterscheiden.
• Lösung:
  • Maschinelles Lernen Unterstützung: Werkzeuge wie FABRIC GEM verbessern durch die Integration von Multi-Omics-Daten die Effizienz des Screenings von Kandidatengenen auf durchschnittlich 2 Gene/Fall.
  • Funktionale Validierung: Kombination von Tiermodellen (z. B. CRISPR-Bearbeitung) und Organoid-Experimenten zur Validierung der Auswirkungen von Mutationen auf die Proteinfunktion.

Klinische Übersetzungsengpässe

• Herausforderung: Die Pathogenität einiger Varianten ist weiterhin unklar, und die phänotypische Heterogenität muss berücksichtigt werden.
• Lösung:
  • Standardisierte Annotation: Bezugnehmend auf die ACMG-Richtlinien, Kombination von Populationsdatenbanken (z. B. gnomAD) und funktionalen Vorhersagetools (z. B. PolyPhen-2) für eine hierarchische Bewertung.
  • Multizentrische Zusammenarbeit: Aufbau von Datenbanken für seltene Krankheiten (z.B. das "Huabiao-Projekt"), um Variantenhäufigkeit und klinische phänotypische Daten auszutauschen.

Ethische und Datenschutzfragen

• Herausforderung: Wie man Patienten Rückmeldung zu sekundären Befunden (z. B. Trägerschaft bei Erwachsenen) gibt.
• Lösung: Entwickeln Sie ethische Richtlinien, klären Sie die informierte Einwilligung vor Tests und bieten Sie Unterstützung durch genetische Beratung an.

IV. Zukünftige Entwicklungsrichtungen

• Technologieintegration: Kombinieren Langzeit-Sequenzierung (wie zum Beispiel PacBio) um komplexe strukturelle Variationen zu analysieren und die diagnostische Genauigkeit zu verbessern.
• Dynamische Überwachung: Verfolgung des Krankheitsverlaufs durch Flüssigbiopsien zur Anleitung personalisierter Behandlungen.
• Arzneimittelentwicklung: Entwurf von kleinen Molekülinhibitoren oder Gentherapien basierend auf pathogenen Genzielen, wie z.B. metabolischen Interventionen, die DHODH anvisieren.

V. Fazit

Die Ganzexom-Sequenzierung ist zu einem "Kernwerkzeug" in der Forschung zu seltenen Krankheiten geworden und spielt aufgrund ihrer hohen Effizienz und Genauigkeit eine entscheidende Rolle bei Diagnose, Behandlung und Grundlagenforschung. Mit sinkenden Technologiekosten und der Integration von Multi-Omics wird erwartet, dass sie in Zukunft "einen Test für mehrere Anwendungen" ermöglicht und seltene Krankheiten von "unheilbar" zu "präziser Intervention" vorantreibt.

Referenzen

1. Liu J, Zheng Y, Huang J, Zhu D, Zang P, Luo Z, Yang Y, Peng Y, Xiao Z, Zhu Y, Lu X. Erweiterung der Genotypen und Phänotypen für 19 seltene Krankheiten durch Exom-Sequenzierung, die in der pädiatrischen Intensivstation durchgeführt wurde.. Hum Mutat. 2021 Nov;42(11):1443-1460.
2. Glotov OS, Zhuchenko NA, Balashova MS, Raspopova AN, Tsai VV, Chernov AN, Chuiko IV, Danilov LG, Morozova LD, Glotov AS. Die Vorteile der Whole-Exome-Sequenzierung bei derDifferentialdiagnose von HypophosphatasieInt J Mol Sci. 31. Oktober 2024;25(21):11728.
3. Jung J, Lee JH, Park YS, Seo GH, Keum C, Kang HG, Lee H, Lee SK, Lee ST, Cho H, Lee BH. Ultrarare Nierenerkrankungen, die mit Whole-Exome-Sequenzierung diagnostiziert wurden: Nutzen in der Diagnose und BehandlungBMC Med Genomics. 3. Juli 2021;14(1):177.