Was ist CUT&Tag-Sequenzierung? Ein vollständiger Leitfaden für Anfänger

Traditionell ChIP-seq beruht auf komplexen Schritten wie Formaldehyd-Quervernetzung und ultrasonischer Fragmentierung, die unter Engpässen leiden, einschließlich großer Probenanforderungen (Millionen von Zellen), langen experimentellen Zyklen (5-7 Tage) und hohem Hintergrundrauschen, was seine Anwendung in seltenen Proben (z.B. Einzelzellen, klinisches Biopsiegewebe) und Studien zu niedermolekularen Proteinen einschränkt.

CUT&Tag Die Technologie der (Cleavage Under Targets and Tagmentation) revolutioniert die Chromatinforschung, indem sie Antikörper-Zielgerichtetheit mit der Aktivität der Tn5-Transposase verbindet – sie erfasst direkt DNA-Fragmente, die an Zielproteine gebunden sind, ohne Quervernetzung, und fügt gleichzeitig Sequenzierungsadapter hinzu, wodurch der Probenbedarf auf 1000 Zellen oder sogar auf Einzelzellniveaus reduziert und der experimentelle Zyklus auf 1 Tag verkürzt wird.

Dieser Artikel zielt darauf ab, die grundlegenden Prinzipien, experimentellen Verfahren, technischen Vorteile und typischen Anwendungs-szenarien (Histonmodifikation, Lokalisierung von Transkriptionsfaktoren) von CUT&Tag systematisch zu analysieren, um grundlegenden und klinischen Forschern zu helfen, die zugrunde liegende Logik und den praktischen Wert dieser Technologie schnell zu erfassen und methodologische Unterstützung für die Durchführung von hochauflösenden Untersuchungen zu bieten. epigenetische Forschung.

Was ist CUT&Tag-Sequenzierung?

CUT&Tag ist eine antikörpergesteuerte Forschungs-technologie zur Untersuchung von DNA-Protein-Interaktionen. Sie verwendet eine modifizierte Tn5-Transposase, um den DNA-Bereich, der an das Zielprotein gebunden ist, präzise zu spalten und direkt Sequenzierungsadapter hinzuzufügen, was eine schnelle Konstruktion von Hochdurchsatz-Sequenzierungsbibliotheken ermöglicht. Das grundlegende Prinzip ist: Antikörper werden verwendet, um spezifische Proteine (wie Histonmodifizierer oder Transkriptionsfaktoren) zu erkennen, das Tn5-Transposase-Komplex, das den Sequenzierungsadapter trägt, wird gezielt an den Ziel-DNA-Bereich gebunden. Magnesiumionen aktivieren die Transposase, um die DNA zu spalten und den Adapter einzufügen, und schließlich ergibt die PCR-Amplifikation die Sequenzierungsbibliothek.

Im Vergleich zu herkömmlichem ChIP-seq beseitigt CUT&Tag die Notwendigkeit von Formaldehyd-Quervernetzung und ultraschallgestützter Fragmentierung, verkürzt den experimentellen Zyklus auf einen Tag und bietet ein geringeres Hintergrundrauschen sowie ein höheres Signal-Rausch-Verhältnis.

In-situ-Verkettung für CUT&Tag-Chromatinprofilierung (Kaya-Okur HS et al., 2019)

CUT&Tag-Technologie-Workflow

1. Probenverarbeitung

• Nukleare Extraktion: Lebende Zellen oder Kerne werden mit ConA-Magnetperlen extrahiert, und die Permeabilität der Kernmembran wird durch eine Digitonin-Durchlässigkeitsbehandlung erhöht.

• Antikörperinkubation: Der primäre Antikörper bindet spezifisch an das Zielprotein (z.B. H3K27me3), und der sekundäre Antikörper verbindet den Protein A/G-Tn5 Transposase-Komplex.

2. Transpositionsreaktion

• DNA-Schneiden und Adapterhinzufügung: Das Tn5-Enzym wird in einem Mg²⁺-haltigen Puffer aktiviert, um die Ziel-DNA-Region zu schneiden und Sequenzierungsadapter einzufügen.

• Fragmentreinigung: Der DNA-Fragmente wird durch Verdau mit Proteinase K gereinigt, um Antikörper und Transposasen zu entfernen.

3. Bibliothekskonstruktion und Sequenzierung

• PCR-Amplifikation: Der gereinigte DNA-Fragment wird amplifiziert, wobei die Endreparatur- und Ligationsschritte der traditionellen ChIP-seq vermieden werden.

• Hochdurchsatz-Sequenzierung: Die Paar-End-Sequenzierung wird mit der Illumina-Plattform durchgeführt, um die Sequenzinformationen der Zielregion zu erhalten.

Datenanalyse-Workflow

1. Qualitätskontrolle und Ausrichtung

• Qualitätskontrollwerkzeuge: FastQC überprüft die Sequenzierungsqualität, MultiQC integriert Berichte mit mehreren Indikatoren.

• Ausrichtungsparameter: Verwenden Sie Bowtie2, um sich an das Referenzgenom auszurichten, und setzen Sie die Parameter "local" und "very-sensitive", um die Ausrichtungsrate zu optimieren.

2. Peak-Erkennung

• Werkzeugauswahl: MACS2 (empfohlene Parameter: "nomodel", "shift", "75", "extsize", "150") oder SEACR.

• Schlüsselschritte: Unterscheiden Sie spezifische Bindungssignale von Hintergrundrauschen und erstellen Sie eine "narrowPeak"-Datei.

3. Funktionale Annotation und Visualisierung

• Genannotierung: Verwenden Sie ChIPseeker oder bedtools, um Peak-Positionen mit Gen-Promotoren, Exons und anderen Regionen zu verknüpfen.

• Visualisierungstools: IGV zeigt die Verteilung der Peaks an, und Heatmaps analysieren die Bindungsstärke spezifischer Regionen (wie Promotoren).

CUT&Tag vs. ChIP-seq: Eine vergleichende technische Analyse

Kernanwendungen von CUT&Tag

1. Analyse der Histonmodifikationen

Erkennung von genomweiten Histonmodifikationen (z. B. H3K27me3, H3K4me1), um epigenetische Regulationsmechanismen der Genstilllegung oder -aktivierung aufzudecken.

Fallstudie: Shi J et al. verwendeten die CUT&Tag-Technologie, um die hochauflösende genomweite Verteilung von vier Histonmodifikationen (H3K4me1, H3K4me3, H3K27ac, H3K27me3) über sieben embryonale Entwicklungsstadien (vom Keimbud bis zur Walnuss-Stufe) zu kartieren. Die Analyse der Dynamik des Chromatinzustands ergab:

• Die Dynamik der Histonmodifikationen (z. B. H3K4me3-Anreicherung in Promotoren, H3K27ac-Markierung von Enhancern) war sehr konsistent mit dem Zeitverlauf der Transkriptomdaten, insbesondere während der ZGA (Vor-Blastozysten-Phase), wo die Chromatinöffnung und die transkriptionale Aktivierung synchronisiert waren (deutlich erhöhte Genexpression während der Blastozysten-Phase).

• Dies offenbarte den Mechanismus, durch den die Umprogrammierung von Histonmodifikationen (z. B. zunächst H3K27me3, gefolgt von einer späteren Hochregulierung von H3K4me1/3) und die transkriptionale Aktivierung synergistisch die Entwicklung in der embryonalen Entwicklung von L. vannamei vorantreiben.

• Die CUT&Tag-Technologie hat erstmals eine hochauflösende dynamische Landschaft von Histonmodifikationen während der embryonalen Entwicklung von L. vannamei enthüllt, die den synergistischen Regulationsmechanismus zwischen Chromatinzustandsübergängen und Genexpression aufzeigt, wichtige Entwicklungs gene und cis-regulatorische Elemente identifiziert und den ersten epigenetischen Rahmen für Krebstierembryonen bereitstellt. Epigenomik, ZGA-Vorschrift und Aquakulturforschung.

Qualitätsbewertung von CUT&Tag im Nauplius-III-Stadium (Shi J et al., 2025)

2. Forschung zur Genomregulation

Diese Forschung zeigt die Verteilung und dynamischen Veränderungen von G4 und R-Schleifen im Genom und bietet neue Einblicke in die nicht-klassische Genomstruktur und die Stressregulation.

Fallstudie: Li C et al., Verwendung von G4-CUT&Tag und R-Schleife CUT&Tag-Technologienentdeckt:

• Kartierung des gesamten Genoms endogener G4-Bindungsstellen: In HEK293T-Zellen wurden 8195 G4-Bindungsspitzen identifiziert (G4-Autobiotinisierungsmethode), wobei fast 80% in Promotorregionen und der Rest in Intron/intergenen Regionen lokalisiert waren; diese Spitzen überlappten stark mit G4-CUT&Tag-Signalen (72%) und waren empfindlich gegenüber G4-Liganden (wie TMPyP4).

• Hemin-Behandlung fördert die G4-Bildung: 2 Stunden Hemin-Behandlung erhöhten signifikant die Bindung von Hemin an G4-CUT&Tag-Signale in Promotoren (N=5858) und Enhancern (N=612), was darauf hindeutet, dass Hemin die Bildung von G4-Strukturen in spezifischen Regionen fördert.

• R-loop CUT&Tag-Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung mit Hemin die R-Loop-Signalisierung der Heminbindung an Promotoren und Enhancer reduziert (Reduzierung der DNA:RNA-Hybridstruktur).

Genomweite Profilierung von Hemin-Bindungsstellen unter Verwendung von Biotin-PEG4-Hemin und G4-Selbstbiotinylierungsreaktion (Li C et al., 2022)

Forschung zu Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen

Präzise Lokalisierung der DNA-Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren zur Aufklärung ihres regulatorischen Netzwerks bei der Gentranskription.

Fallstudie: Li Y et al. verwendeten die CUT&Tag-Technologie, um die Chromatinbindungsmerkmale und regulatorischen Mechanismen von LDB1 und seinen verwandten Faktoren zu analysieren. Die wichtigsten Ergebnisse sind wie folgt:

• LDB1 CUT&Tag-Analyse von sechs T-CEM-Zellen identifizierte 26.479 LDB1-Bindungsspitzen:
  • Ungefähr 40 % der Peaks befanden sich in Promotorregionen, und etwa 60 % lagen in enhancerbezogenen Regionen (intergen oder intronisch);
  • Die modale Analyse dieser Spitzen zeigte, dass die LDB1-Bindungsstellen reich an wichtigen Transkriptionsfaktormotiven waren, die mit dem Fortschritt von T-ALL assoziiert sind (wie ETS1, RUNX1, GATA3 und MYB).
• Der zentrale transkriptionale Regulationskreis, der in T-ALL-Patientenproben konstruiert wurde, wurde mithilfe von CUT&Tag (basierend auf H3K27ac ChIP-Daten) validiert;
• Die Ko-Lokalisierung von LDB1 mit IRF1, ERG und ETV6 auf Chromatin wurde beobachtet, und diese Faktoren zeigten eine gegenseitige transkriptionale Aktivierung, was darauf hindeutet, dass LDB1 ein wichtiger Erhalter des Kernschaltkreises ist. Die CUT & Tag-Analyse anderer T-ALL-Zelllinien (Loucy, Molt-4, J.gamma1) bestätigte, dass der LDB1-Komplex an diesen Enhancer bindet und dass dieser Enhancer eine Schlüsselregulationsregion für die MYB-Transkription ist (die MYB-Expression nimmt ab und die Zellproliferation wird nach CRISPR-Interferenz gehemmt).

Verteilung der LDB1-Bindung an genomische Regionen in den 6 T-CEM-Zellen, bewertet durch CUT&Tag (Li Y et al., 2024)

4. Krankheitsmechanismen und Arzneimittel-Screening

Analyse der Chromatinbindungsmerkmale von krankheitsbezogenen Proteinen zur Erforschung therapeutischer Ziele.

Beispiel: Zhao H et al., unter Verwendung von CUT&Tag-seq (H2AZ1-Antikörper), RNA-Seqund ATAC-seq Techniken, die Beziehung zwischen den Ablagerungsmustern von H2AZ1-Chromatin und der Regulation der Genexpression in Lungenkrebszellen wurde aufgedeckt. Die wichtigsten Ergebnisse sind wie folgt:

• H2AZ1-Bindungspeaks sind stark angereichert um Transkriptionsstartstellen (TSS) (ungefähr 40 % in Promotorregionen ≤1 kb, 60 % in enhancerbezogenen Regionen wie intergenen/intronischen Regionen); die Bindung ist in Genkörperregionen weniger häufig, und fast keine Bindung erfolgt in der TSS-"0-Region" (RNA-Polymerase-II/Transkriptionsfaktor-Bindungsregion).

• Die Genexpression ist signifikant erhöht, wenn H2AZ1 nur an Promotorregionen ≤1kb oder 5'UTR-Regionen bindet; die Genexpression wird verringert/ausgeschaltet, wenn es an Genkörper bindet (Promotor 1-3kb, Introns, Exons usw.) oder gar nicht.

• Die Genexpression war signifikant höher, wenn die Ablagerung von H2AZ1 mit der Öffnung der Chromatinregion im Promotorbereich kombiniert wurde, als wenn nur H2AZ1 gebunden war oder nur das Chromatin offen war. Die TCGA-Daten bestätigten diese Beziehung als in normalem Lungengewebe sowie in LUAD/LUSC erhalten.

• Die CUT&Tag-Technologie hat klargestellt, dass die Ablagerung von H2AZ1 um die Transkriptionsstartstelle (insbesondere in Promotorregionen ≤1kb) entscheidend für die aktive Genexpression ist und dass ihr synergistischer Effekt mit der Chromatinöffnung die Genexpression reguliert. Sie hat auch gezeigt, dass H2AZ1 an mehreren Krebswegen beteiligt ist und die Genexpression bidirektional regulieren kann, was neue Einblicke in die epigenetischen Mechanismen von Lungenkrebs bietet.

Die Bindung von H2AZ1 an die TSS führt zu einer höheren Genexpression und beeinflusst multiple krebsbezogene Signalwege, wie durch CUT&Tag-seq und RNA-seq gezeigt wurde (Zhao H et al., 2024).

Technische Einschränkungen und Lösungen

• Einschränkungen:
  • Verlässt sich auf hochwertige Antikörper; unspezifische Bindungen können die Ergebnisse beeinflussen.
  • Begrenzte Auflösung für sehr lange DNA-Fragmente (>1 kb).
• Lösungen:
  • Priorisieren Sie validierte ChIP-Grad-Antikörper.
  • Ergänzen Sie lange Fragmentinformationen, indem Sie sie mit ATAC-seq oder MNase-seq kombinieren.

Fazit

CUT&Tag hat sich mit seinem niedrigen Startbetrag, hoher Sensitivität und schnellem Workflow zu einem wichtigen Werkzeug in der Epigenetikforschung entwickelt. Ob es um Histonmodifikationen, die Lokalisierung von Transkriptionsfaktoren oder die Analyse von Krankheitsmechanismen geht, es liefert hochauflösende Karten der Chromatininteraktionen. Für Anfänger wird empfohlen, mit dem Standard-Workflow zu beginnen und schrittweise die Datenanalyse und Ergebnisinterpretation zu meistern.

Die Leute fragen auch

Was ist CUT&Tag-Sequenzierung?

CUT&Tag-Sequenzierung kombiniert die antikörpergerichtete kontrollierte Spaltung durch eine Protein A-Tn5-Fusion mit massiv paralleler DNA-Sequenzierung, um die Bindungsstellen von DNA-assoziierten Proteinen zu identifizieren. Es kann verwendet werden, um globale DNA-Bindungsstellen präzise für jedes Protein von Interesse zu kartieren.

Wie viele Reads für CUT&Tag?

Bibliotheken sollten auf eine Tiefe von 5-8 Millionen Gesamtablesungen sequenziert werden. Für eine ausreichende Abdeckung sollte jede Bibliothek 3-5 Millionen eindeutige Ablesungen erzeugen (nachdem Mehrfachzuordnungen, doppelte Ablesungen und Ablesungen in Regionen der DAC-Ausschlussliste entfernt wurden).

Was ist der Unterschied zwischen CUT&RUN und CUT&Tag?

CUT&RUN verwendet Ca²⁺-aktivierte pAG-MNase, um die DNA zu spalten, während CUT&Tag Mg verwendet.²⁺-aktiviertes pAG-Tn5, um die DNA zu schneiden. Das Tn5 ist mit Illumina-Adaptern geladen, die während des Schneidprozesses dem Chromatin hinzugefügt werden.

Wie funktioniert die Tn5-Tagmentierung?

Illumina entwickelte das Tagmentationsprotokoll, bei dem ein modifiziertes Tn5-Enzym doppelsträngige DNA schneidet und gleichzeitig die Linkersequenzen, die für die Illumina-Sequenzierung erforderlich sind, an beiden Enden ligiert.

Was ist die Sequenzierungstiefe von CUT&Tag?

CUT&Tag, die Transposase, schneidet die Chromatin nur in unmittelbarer Nähe zur Proteinbindungsstelle, was zu kürzeren DNA-Längen führt, die sequenziert werden. Dies ermöglicht eine geringere Sequenzierungstiefe (3-5 Millionen Reads), um robuste Daten zu generieren, mit einem geringeren Hintergrundsignal als die meisten ChIP-Seq-Assays.

Referenzen

1. Kaya-Okur HS, Wu SJ, Codomo CA, Pledger ES, Bryson TD, Henikoff JG, Ahmad K, Henikoff S. CUT&Tag für effizientes epigenomisches Profiling von kleinen Proben und Einzelzellen. Nat Commun2019 Apr 29;10(1):1930.
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