Integration von Whole Exome Sequencing mit anderen genomischen Ansätzen

Whole-Exom-Sequenzierung (WES) hat erfolgreich etwa 85% der bekannten pathogenen Mutationen identifiziert, indem etwa 1%-2% der Exonregionen (wichtige protein-codierende Regionen) im Genom gezielt erfasst wurden. Es ist zu einer Kerntechnologie für die Diagnose genetischer Erkrankungen und die Tumorforschung geworden. Allerdings, WES hat erhebliche Einschränkungen: Es kann keine regulatorischen Variationen in nicht-codierenden Regionen (wie Promotoren und Spleißstellen), Pseudogen-Interferenzen und dynamische Mutationen (wie die CGG-Duplikationsverstärkung im Fragilen-X-Syndrom) erkennen. Darüber hinaus hat WES eine begrenzte Fähigkeit, komplexe Phänotypen (wie die Heterogenität von Krebs und das immunologische Mikroumfeld) zu analysieren, was eine Integration mit anderen Omics-Technologien erfordert, um diese Einschränkungen zu überwinden.

Multi-Omics-Integrationsstrategien (wie WES+)RNA-Seq und WES+epigenetisch Die Analyse umfasst umfassendere molekulare Informationen durch komplementäre Techniken, was die diagnostischen Raten erheblich verbessert (z. B. die Entdeckung von TP53-Mutations-gestützten Glykolyseweg-Abnormalitäten bei Speiseröhrenkrebs) und die Mechanismen der Wirts-Mikroben-Interaktion aufdeckt (z. B. die Auswirkungen von GPR151-Mutationen auf die Zusammensetzung der Darmmikrobiota bei IBD). Forschungen von Konsortien wie der GREGoR-Allianz haben zudem Technologien wie Long-Read-Sequenzierung und die Konstruktion von Multi-Omics-Matrizen weiter vorangetrieben, um Herausforderungen im Zusammenhang mit Variationen in nicht-kodierenden Regionen und komplexen genetischen Mustern zu bewältigen. Derzeit ist die Integration von WES mit anderen Omics zu einer zentralen Richtung in der Präzisionsmedizin geworden, die eine systematische Perspektive zur Aufklärung von Krankheitsmechanismen, zielgerichteten Therapien und der Entwicklung von Biomarkern bietet.

I. Technologische Komplementarität: Überwindung der Einschränkungen der Einzel-Omik-Analyse

Während WES 85 % der bekannten pathogenen Mutationen abdecken kann, haben seine Einschränkungen die rasche Entwicklung von Multi-Omics-Integrationsstrategien angestoßen. Folgend sind wichtige komplementäre Richtungen und typische Fälle aufgeführt:

Analyse von nicht-kodierenden Regionen und regulatorischen Variationen

• WES hat eine begrenzte Fähigkeit, tiefe intronische Varianten und andere nicht-kodierende regulatorische Elemente (wie distale Promotoren und Enhancer) zu erkennen. Im Gegensatz dazu kann RNA-seq direkt abnormale Spleißvorgänge und die Aktivierung kryptischer Spleißstellen aufdecken, die durch diese versteckten intronischen Mutationen oder sogar synonyme Mutationen innerhalb von Exons verursacht werden (z. B. TP53-Mutationen, die zu Fehl-Spleißungen bei Speiseröhrenkrebs führen). Studien zeigen, dass die Abdeckung aller Variantentypen (WES bietet eine hochauflösende Identifizierung von DNA-Punktmutationen/niedrigfrequenten Mutationen, scRNA-seq analysiert das Transkriptom + CNV ergänzt große Fragmentmutationen) die Einschränkungen einzelner Technologien ergänzt (WES hat eine niedrige VAF-Empfindlichkeit, scRNA-seq hat eine unzureichende DNA-Erkennung), wodurch eine duale Verifizierung und Korrelation zwischen DNA und Transkriptom erreicht wird und das "Mutations-Expressions"-Panorama der Krankheit genau analysiert wird.
  • Lu W et al. entdeckten durch die kombinierte Anwendung von Whole-Exome-Sequenzierung (WES) und Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) (ergänzt durch Immunhistochemie, CellChat-Analyse usw.) die spezifischen Merkmale des VHL-germline mutierten klarzelligen Nierenzellkarzinoms (ccRCC) – das Vorhandensein von OBP2A/BCR1 Translokationsmutationen auf DNA-Ebene (selten), hohe Expression von COX7A1 auf Transkriptomebene (assoziiert mit guter Prognose) und umfangreiche Interaktion zwischen TAM und CD8+ depletierten T-Zellen in der Tumormikroumgebung (entscheidend für die Immunsuppression), was sein "Mutation-Transkription-Mikroumgebung"-Panorama offenbart und eine Grundlage für die Diagnose (gezielte Sequenzierung) und Behandlung (Immunintervention) von seltenem ccRCC bietet.

Genmutationseigenschaften von ccRCC mit VHL Keimbahnmutation (Lu W et al., 2024)

• Epigenetische AnalyseAbnormale DNA-Methylierung ist mit der Genstilllegung verbunden. Zum Beispiel wurden durch die Integration von Multi-Omics (WES+RRBS+RNA-seq) vier Methylierungsuntergruppen identifiziert: demethylierte DEM, niedrig-methylierte LOW, intermediäre INT und hoch-methylierte CIMP. Die Ergebnisse zeigten, dass die LOW-Untergruppe immunaktiviert war (lange Überlebenszeit, ICB-sensitiv) und die CIMP-Untergruppe immununterdrückt (kurze Überlebenszeit, ICB-resistent). Darüber hinaus können DNMT-Hemmer Demethylierung induzieren, um den LOW-Phänotyp nachzuahmen, was eine Grundlage für präzise Immuntherapien bietet (Anichini A et al., 2025).

Erkennung von dynamischen Mutationen und strukturellen Variationen

• Long-Read-Sequenzierung (ONT)PacBio): Behandelt das Problem der fehlenden Pseudogene im WES (wie die Pseudogenregion des PKD1-Gens) und dynamischen Mutationen (wie der CGG-Duplizierung in Syndrom von Fragile X). Klinische Richtlinien empfehlen das kombinierte LR-PCR+NGS-Protokoll, das die Entdeckungsrate von PKD1-Mutationen von 70 % auf 90 % erhöht.

• WGS Ergänzung: WGS kann komplexe strukturelle Variationen (wie chromosomale Inversionen und balancierte Translokationen) erfassen, die von WES übersehen werden. Zum Beispiel deckt WGS die nicht-kodierenden Regionen des gesamten Genoms ab und hat Variationen in regulatorischen Regionen (Promotoren, Enhancern), intergenen Variationen und geschlechtsspezifischen Assoziationen entdeckt, die von WES nicht erkannt werden konnten. Es hat auch einen neuartigen Mechanismus aufgezeigt, durch den niedrigfrequente Variationen an DKD durch transkriptionale Regulation (wie den METTL4 Enhancer) beteiligt sind. Diese Ergebnisse ergänzen die Einschränkungen von WES, das sich nur auf Exonvariationen konzentriert, und bieten neue Ziele in nicht-kodierenden Regionen für die präzise Diagnose und Behandlung von DKD (Haukka JK et al., 2024).

Studienaufbau für Einzelvariant- sowie Gen- und intergenische Regionenaggregatanalysen (Haukka JK et al., 2024)

Wirt-Mikrobe-Interaktionsmechanismen

Metagenomische Analyse: In Studien zur entzündlichen Darmerkrankung (IBD) fand die WES, dass häufige Varianten von immunbezogenen Genen (wie MYRF und IL17REL) mikrobielle Stoffwechselwege (wie die Synthese von kurzkettigen Fettsäuren) und deren Häufigkeit (wie Alistipes) durch mikrobielle quantitative Merkmalsloci (mbQTLs) regulieren und krankheitsspezifische genetisch-mikrobielle Interaktionen (wie BTNL2 und TNFSF15) identifizieren. Die metagenomische Analyse ergab, dass die Häufigkeit des Phylum Bacteroidetes und der Rückgang von Firmicutes (wie Faecalibacterium) im Mikrobiom von IBD-Patienten erhöht waren, während der Stoffwechselweg für kurzkettige Fettsäuren (Pyruvat → Propionsäure/Essigsäure) reduziert war. Darüber hinaus waren mikrobielle Merkmale mit Wirtsvarianten (wie MYRF und IL17REL) assoziiert (Hu S et al., 2021).

II. Technische Wege und Innovationen in der gemeinsamen Analyse von Multi-Omics

Technologie-Kombinationsoptimierungsstrategie

• Niedrig-Tief WGS + Hoch-Tief WES (WEGS): Die Kombination von Niedrig-Tief WGS (2X/5X) mit wiederverwendetem WES verbessert die Rückrufrate (z. B. beträgt die SNV-Rückrufrate von 8 wiederverwendeten + 5X WGS 0,9847 > 0,9830 ohne wiederverwendetes WES), was eine Leistung im kodierenden Bereich erzielt, die mit WES vergleichbar ist, und mehr populationsspezifische nicht-kodierende Varianten erfasst (Identifizierung von 938 zusätzlichen SNVs und 60 % mehr Indels als Genotypisierungsarrays).
  • Es erreicht eine hochpräzise Erkennung von kodierenden Regionen (durchschnittliche Abdeckung von 120×) zu 1,7-2 Mal den Kosten, während gleichzeitig Varianten in nicht-kodierenden Regionen (z. B. Enhancer-SNPs) erfasst werden. In einer Kohorte von 862 PAD-Patienten identifizierte WEGS 44,74 Millionen Varianten (darunter 12,89 Millionen neue Varianten), die alle bekannten PAD-Loci abdecken und 4056 mehr Varianten pro Locus als Arrays identifizieren (Bhérer C et al., 2024).

Übersicht des experimentellen Designs von WEGS (Bhérer C et al., 2024)

• Komplementäre gezielte Erfassungstechnologien: Die Kombination aus HaloPlex (selektive Zirkularisierung) und SureSelect V5 (hybride Erfassung) deckt 97 % des CDS-Bereichs ab und erkennt somatische Punktvarianten mit niedrigem VAF (< 10 %) genau (wie MTOR-Intraframe-Deletionen und MAP2K1/PTPN11-Varianten) und löst die Erfassungsherausforderung extrem niedriger VAF somatischer Varianten (Typ IIB < 4 %, Typ I < 10 %) in FCD.
  • Fujita A et al. entdeckten durch eine Kombination von Technologien, dass bei epilepsiebezogenen Hirnmalformationen (wie fokaler kortikaler Dysplasie FCD und hemisphärischem Megagyre HME) somatische/germline Varianten in den PI3K-AKT3-mTOR- und RAS-MAPK-Signalwegen angereichert sind (wie intraframe Deletionen von mTOR, MAP2K1/PTPN11-Varianten und große CNVs von DEPDC5/TSC1), und diese Varianten aktivieren die Signalsysteme der Wege (erhöhtes p-S6/p-ERK). Dies zeigt, dass die abnormale Aktivierung dieser Signalwege eine häufige Ursache für epileptische Hirnmalformationen ist und molekulare Beweise für eine präzise Diagnose (wie gezielte Sequenzierung zur Erkennung von somatischen Varianten mit niedrigem VAF), Behandlung (wie mTOR-Inhibitoren) und prognostische Bewertung (Überwachung der Aktivität der Signalwege) liefert.

Datenintegration und intelligente Analyse

Familienanalyse und Mendelsche Vererbung

• WES-Kosegregationsvalidierung: Bei dominanten genetischen Erkrankungen (z. B. Chorea Huntington) werden WES-Daten verwendet, um Varianten zu identifizieren, die mit dem Phänotyp des Patienten kosegregieren (z. B. ≥2 Generationen von Patienten in einer Familie, die dieselbe Exon-Mutation tragen), kombiniert mit HPO-Terminologie zur Standardisierung der phänotypischen Beschreibungen (z. B. "Dystonie").
• Rezessive Vererbung Filterung: Für rezessive genetische Erkrankungen (z. B. Mukoviszidose) werden nur homozygote oder zusammengesetzte heterozygote Mutationen beibehalten (z. B. die Kombination p.Arg117His/p.Gly542X des CFTR-Gens), während harmlose Varianten mit einer Populationshäufigkeit von >1 % ausgeschlossen werden (basierend auf der gnomAD-Datenbank).

Funktionale Annotation und Strukturvorhersage

• AlphaMissense-WES-Integration: Für Varianten im Exonbereich von WES wird AlphaMissense verwendet, um die Auswirkungen von Mutationen auf die Proteinstabilität vorherzusagen (z. B. führt BRCA1 p.Arg1753Gln zu einer konformationellen Änderung im BRCT-Domäne, was ΔΔG = 3,2 kcal/mol vorhersagt).
• WES-spezifische Annotation: Die funktionale Annotation (z. B. Missense-Mutationen, Frameshift-Mutationen) wird für Varianten im Exonbereich, die durch WES erfasst wurden, mit dem ANNOVAR-Tool durchgeführt und mit der ClinVar-Datenbank verknüpft (z. B. wird TP53 p.Arg273His als pathogen gekennzeichnet).

Maschinenlernen-gestützte Pathogenitätsbewertung

• REVEL-Integrierte Pathogenitätsbewertung: Durch die Integration von REVEL-Scores (einer Ensemble-Methode, die auf evolutionärer Erhaltung und biophysikalischen Merkmalen basiert) mit WES-spezifischen Sequenzierungsparametern (z. B. Exonabdeckung >20× und variant allele frequency (VAF) >15%) können Forscher ein robusteres Modell zur Vorhersage der Pathogenität erstellen. Dieser kombinierte Ansatz (mit einer AUC von 0,89) bietet eine 12%ige Verbesserung der diagnostischen Genauigkeit im Vergleich zu allgemeinen Modellen, indem Sequierungsartefakte herausgefiltert und funktional kritische Mutationen priorisiert werden.
• LLM-unterstützte Literaturrecherche: Klinische Beweise im Zusammenhang mit WES-Varianten werden automatisch aus PubMed extrahiert, wobei das EvAgg-Großmodell verwendet wird (z. B. "p.Val600Glu ist mit der Resistenz gegen BRAF-Inhibitoren bei Melanomen assoziiert"), und eine Evidenzkette (Evidenz auf PS3/BS3-Niveau) wird nach manueller Überprüfung erstellt.

Klinische translationale Fallstudie

• Präzisionsbehandlung von Speiseröhrenkrebs: WES in Kombination mit Proteomik enthüllte wichtige Genmutationen (TP53, MACF1, AKAP9), die die Proteinfunktionen (DNA-Replikation, Wnt-Signalgebung, Glykolyse) regulieren. Eine frühe Amplifikation des Chromosoms 3q fördert das Ca²⁺-Signal und die Proliferation, und acht dynamische Signalwege treiben die Progression in den Stadien voran. Umweltvariationen (Alkohol/Nichtraucher-Alkoholkonsum) fördern die DNA-Replikation/Mitosen durch SBS16/APOBEC-Eigenschaften. Das Ziel PGK1 (S203-Phosphorylierung fördert die Glykolyse, Gemcitabin-Inhibition) wurde identifiziert, was die ursächliche Kette von "genomischer Variation - Proteinfunktion - Wegprogression" aufschlüsselt und eine Grundlage für präzise Diagnosen und Behandlungen bietet (Li L et al., 2023).
• RP-ILD-Diagnose: WES identifizierte sechs Varianten des IFIH1-Gens, und Sanger-Sequenzierung bestätigte die Assoziation zwischen diesen Varianten (insbesondere rs12479043, rs10930046 und rs141134657) und dem Risiko für ILD, positiven Anti-MDA5-Antikörpern und akutem ILD-Ausbruch bei DM-Patienten, was eine Grundlage für die Untersuchung genetischer Biomarker für RP-ILD bietet (Okamoto M et al., 2025).

III. Herausforderungen und Grenzrichtungen

Technische Engpässe und Lösungen

• Datenkomplexität: Die Einzelzellsequenzierung (scRNA-Seq) weist hohe Rauschpegel auf, was die Entwicklung von Rauschreduktionsalgorithmen (wie der Batch-Korrektur in Seurat V5) erfordert. Die Fehlerraten bei Langzeitsequenzierungen (10%-15%) müssen durch Fehlerkorrekturalgorithmen (wie Canu) optimiert werden.
• Kosten-Effizienz-Balance: WGS kostet 3-5 Mal mehr als WES, aber regionsspezifisches Sequencing (wie nur Exons + wichtige regulatorische Regionen) kann die Kosten auf 60% von WGS reduzieren.

Klinische Anwendungsherausforderungen

• Ethik und Datenschutz: Standardisierte Datenbanken (wie das All of Us-Projekt) müssen eingerichtet werden, die verschiedene ethnische Gruppen abdecken (wie HLA-regionale Variationen in ostasiatischen Populationen), um diagnostische Verzerrungen zu vermeiden.
• Dynamische Mutationsüberwachung: Entwicklung von Echtzeit-PCR-Technologien (wie TP-PCR) zur Amplifikation der CGG-Wiederholungen im FMR1-Gen, um eine dynamische pränatale Überwachung zu erreichen.

Zukünftige Trends

• Modulares Analyse-Framework: Unterstützung für dynamisch aktualisierte ACMG-Richtlinien und aufkommende Datenströme (wie Mikrobiom-Wirt-Interaktionen). Zum Beispiel integriert GATK4 ein Modul zur funktionalen Annotation des Mikrobioms, um die Fähigkeit zur Aufklärung von IBD-Mechanismen zu verbessern.
• Präzisionsbehandlung Übersetzung: Personalisierte Arzneimittelzielscreening basierend auf WES + Epigenetik. Zum Beispiel entdeckte WES, dass IDH1-Mutationen Gliome antreiben, und in Kombination mit der Methylierungsanalyse leitete dies den Einsatz von IDH-Inhibitoren (wie Ivosidenib) ein.

Fazit

Die Integration von WES mit anderen Omics-Technologien (RNA-Seq, WGS, Einzelzell-Sequenzierung) hat die Diagnoserate genetischer Erkrankungen von 35 % auf 65 % erhöht. In Zukunft ist es notwendig, einen geschlossenen Kreislauf von "Daten-Algorithmus-Klinik" aufzubauen, um mit Multi-Omics-Matrizen die Heterogenität von Krankheiten zu analysieren und letztendlich einen Sprung von der "empirischen Medizin" zur "digitalen Zwillingsmedizin" zu erreichen.

Die Leute fragen auch

Warum würde ein Patient die Ganzgenomsequenzierung anstelle der Ganzexomsequenzierung wählen?

Obwohl derzeit teurer, ist WGS leistungsfähiger als WES zur Erkennung potenziell krankheitsverursachender Mutationen in WES-Regionen, insbesondere solcher, die auf SNVs zurückzuführen sind. Die Ganzexomsequenzierung (WES) wird routinemäßig verwendet und wird schrittweise für die Erkennung seltener und häufiger genetischer Varianten beim Menschen optimiert.

Was sind die Einschränkungen von Exom-Sequenzierung?

Die Exom-Sequenzierung zielt nicht auf 100 % der Gene im menschlichen Genom ab; etwa 97 % der Exons werden erfasst. Allerdings sind etwa 10 % der Exons möglicherweise nicht ausreichend abgedeckt, um heterozygote Varianten zuverlässig zu identifizieren. Jeder Einzelne kann leicht unterschiedliche Abdeckungsrenditen über das Exom hinweg aufweisen.

Welches der folgenden ist ein Vorteil von WGS gegenüber der Exom-Sequenzierung?

Ein großer Vorteil der WGS ist, dass sie einen umfassenderen Überblick über die genetische Zusammensetzung eines Individuums bietet. WGS kann Varianten identifizieren, die im Exom nicht vorhanden sind, einschließlich solcher in nicht-kodierenden Regionen und strukturellen Varianten.

Wie verbessert Multi-Omik die Krebsdiagnose?

Multi-Omics verbessert die Krebsdiagnose, indem Daten aus Genomik, Transkriptomik, Proteomik und Metabolomik integriert werden, was ein umfassendes Verständnis der Tumorbiologie und personalisierte Behandlungsstrategien ermöglicht.

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