Wie man Enhancer durch Sequenzierung untersucht?

Um die Geheimnisse von Enhancern zu entschlüsseln, setzen Wissenschaftler fortschrittliche Sequenzierungstechniken ein. Sequenzierungsmethoden wie ChIP-seq (Chromatin-Immunopräzipitation mit Sequenzierung) und Hi-C (High-Throughput Chromosomen-Konformationsfang) ermöglichen es Forschern, Enhancer-Standorte präzise zu kartieren, Zielgene zu identifizieren und ihre komplexen regulatorischen Mechanismen zu verstehen.

Was ist ein Enhancer?

Enhancer sind bemerkenswerte nicht-kodierende Sequenzen im Genom und sie sind der Schlüssel zur Kontrolle der Genexpression, indem sie Zielgene aktivieren, die von der RNA-Polymerase II (RNAPII) transkribiert werden. Diese wesentlichen Elemente befinden sich überwiegend in intergenen und intronischen Regionen, wobei einige sogar innerhalb von Exons gefunden werden. In diesem Artikel gehen wir auf die Eigenschaften von Enhancern ein und untersuchen die Methoden, die verwendet werden, um sie durch Sequenzierungstechniken zu studieren.

Genomische Enhancer. (Carullo et al., 2019)

• Fernregulierung
  Einer der faszinierendsten Aspekte von Enhancern ist ihre entfernte Natur. Typischerweise befinden sie sich stromaufwärts des Zielgens bei etwa -200 Basenpaaren und können die Transkription entfernter Promotoren verstärken. Sie können sogar die Genexpression in Zielgenen aktivieren, die bis zu einer Million Basenpaare entfernt sind. Ein herausragendes Beispiel dafür ist die regulatorische Beziehung zwischen dem Maus-Shh-Gen und seiner Enhancer-ZRS-Sequenz. ZRS, eingebettet im 5. Intron des Lmbr1-Gens, liegt eine Million Basenpaare vom Shh-Gen entfernt. ZRS orchestriert die Shh-Expression, indem es eine Schleifenstruktur bildet, ein klassisches Beispiel für die Funktionalität von Enhancern.
• Nicht-richtungsabhängiger Einfluss
  Enhancer zeigen eine bemerkenswerte Nicht-Richtungsgebundenheit in ihrer Rolle als transkriptionale Enhancer. Sie können die Genexpression effektiv modulieren, unabhängig davon, ob sie stromaufwärts, stromabwärts oder innerhalb des Zielgens selbst lokalisiert sind. Zum Beispiel kontrolliert ein Enhancer die spezifische Expression des Arabidopsis-Gens. LATERALER SUPPRESSOR (LAS) liegt 3,2 Kilobasen stromabwärts des LAS-Offenen Leserahmens, während der Enhancer-Block C des BLÜHENDE LOKUS T (FT) Das Gen befindet sich etwa 5 Kilobasen stromaufwärts des Gens.
• Gewebespezifische Aktivität
  Enhancer zeigen unterschiedliche Aktivitätsniveaus in verschiedenen Zelltypen oder Geweben. Diese Spezifität wird durch zell- oder gewebespezifische Proteinfaktoren bestimmt. Zum Beispiel weisen die Enhancer von Immunglobulingenen maximale Aktivität ausschließlich in B-Lymphozyten auf. In Insulin-β-Zellen kann ein spezifischer Proteinfaktor den Enhancer des menschlichen Insulingenes aktivieren und die Transkription des Insulingenes fördern. Dieser Faktor ist in anderen Zelltypen nicht vorhanden, wodurch die Expression des Insulingenes hauptsächlich auf Insulin-β-Zellen beschränkt ist.
• Phasische Eigenschaften
  Die Funktionalität von Enhancern ist eng mit der DNA-Konformation verbunden. Die dynamische Konformation der DNA ist entscheidend für ihre Fähigkeit, die Genexpression als Reaktion auf verschiedene Stimuli zu regulieren.
• Einfluss heterologer Arten
  Bemerkenswerterweise können einige Enhancer die Genexpression über Arten hinweg beeinflussen. Mäuse, die menschliche HARE5-Enhancer tragen, zeigen einzigartige Gehirnmerkmale, die ausschließlich in menschlichen Gehirnen vorkommen, wobei die Gehirngröße sogar einen Anstieg von 12 % im Vergleich zu Mausembryonen mit Schimpansen-HARE5-Enhancern aufweist. Dieser Einfluss über Arten hinweg hebt die Vielseitigkeit von Enhancern bei der Förderung artspezifischer Merkmale hervor.
• Reaktionsfähigkeit auf externe Signale
  Bestimmte Enhancer sind dafür bekannt, durch externe Signale aktiviert zu werden. Zum Beispiel können Steroidhormone spezifische Enhancer aktivieren, und der Enhancer des Hitzeschockgens wird bei hohen Temperaturen aktiv, was zur Expression des Gens führt.

Studien von Enhancern durch Sequenzierung

• Transkriptionsfaktor-Motive
  Enhancer sind mit einer Vielzahl von TF-Motiven angereichert. Diese Motive sind spezifische DNA-Sequenzen, die die Bindung von TFs bestimmen und die Aktivierung von Enhancern auslösen. In verschiedenen Arten wurden TF-Motive durch fortschrittliche Techniken sorgfältig vorhergesagt wie ChIP-seq (Chromatin-Immunopräzipitation-Sequenzierung) oder DAP-seq (DNA-Affinitätsreinigung-Sequenzierung)Zum Beispiel hat DAP-seq erfolgreich 529 TF-Motive in Arabidopsis thaliana enthüllt, wodurch die Notwendigkeit für arbeitsintensive, pflanzenspezifische Antikörper gegen Transkriptionsfaktoren umgangen und die Herausforderungen durch niedrige Transkriptionsfaktor-Expressionsniveaus umgangen werden. Im Gegensatz zu ChIP-seq, das typischerweise den Bau von Überexpressionsplasmiden für markierte Zielproteine erfordert, DAP-seq hebt sich als ein In-vitro-Ansatz hervor, der die Notwendigkeit spezifischer Antikörper beseitigt und ihn für Pflanzenarten ohne Transformationssysteme geeignet macht.

Computationaler Ablauf und Methode zur Auswahl der besten PWMs eines TF aus einzelnen Experimenten und des besten PWMs über mehrere Experimente hinweg. (Yu et al., 2021)

• Chromatin-Zugänglichkeit
  Die Zugänglichkeit von Chromatin, definiert durch die Nucleosomenbesetzung und die Wechselwirkungen mit chromatinassoziierten Proteinen, beeinflusst maßgeblich die Bindung von Transkriptionsfaktoren (TF) an regulatorische Sequenzen. Aktive cis-regulatorische Elemente, wie Promotoren und Enhancer, befinden sich überwiegend in offenen genomischen Regionen, die als nucleosomen-defiziente Regionen (NDRs) bekannt sind. NDRs wurden umfassend auf genomweiter Ebene in Arten wie Arabidopsis thaliana, Mais und Reis. Eine hochmoderne Methode namens ATAC-seq (Assay für transposase-zugängliche Chromatin mit Hochdurchsatz-Sequenzierung) hat sich als praktische Alternative zu konventionellen Techniken wie MNase-seq, FAIRE-seq und DNase-seq herauskristallisiert. ATAC-seq bietet zahlreiche Vorteile, darunter seine Einfachheit, verkürzte experimentelle Zeit und minimale Probenanforderungen, die es von seinen Pendants abheben.
  Bitte lesen Sie den Artikel. ATAC-Seq – Eine Methode zur Untersuchung von offenem Chromatin.

Vorhersage von Enhancern aus klinischen ATAC-seq-Proben. (Thibodeau et al., 2018)

• Histonmodifikationen
  Histonmodifikationen spielen eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der Genexpression und der Chromatinzugänglichkeit. In Enhancer-Regionen tragen Nukleosomen spezifische Histonmodifikationen, die ihren regulatorischen Status widerspiegeln. Während Tiere gut charakterisierte Histonmarker haben, wie H3K4me1 für Enhancer, H3K9ac, H4K12ac, H3K14ac und H3K27ac für aktive Enhancer sowie H3K27me3 für inaktive Enhancer, enthüllen Pflanzen allmählich ihre eigenen Feinheiten. Aktive Enhancer in Pflanzen, wie die in Erbsen (PetE) und Mais (b1), sind angereichert mit H3/H4ac und H3K9/K14ac. Darüber hinaus zeigen intergenische NDRs in Reis Korrelationen mit H4K12ac und H3K27me3. Forschungen an Arabidopsis haben eine starke Verbindung zwischen inaktiven Enhancern und H3K27me3 sowie eine noch ausgeprägtere Korrelation zwischen aktiven Enhancern und H3K27ac hervorgehoben. Dies impliziert, dass aktive Enhancer in Pflanzen häufig H3- und H4-Acetylierung aufweisen, während inaktive Enhancer mit H3K27me3 assoziiert sind. Um diese Histonmodifikationen auf genomweiter Ebene zu untersuchen, ChIP-seq bleibt eine weit verbreitete Methode.
  Bitte lesen Sie den Artikel. Wie man ChIP-Seq-Daten analysiert: Von der Datenvorverarbeitung bis zur nachgelagerten Analyse.
• DNA-Methylierung
  DNA-Methylierung spielt eine entscheidende Rolle bei der transkriptionalen Regulation sowohl bei Tieren als auch bei Pflanzen. Wenn ein Enhancer DNA-Methylierung aufweist, kann er einen herunterregulierenden Einfluss auf die Expression von Zielgenen ausüben. Bemerkenswerte Beispiele sind die DNA-Methylierung in den Maisgenen. Fruchtwandfarbe1 (p1) und b1, und die Arabidopsis-Gene BLÜHENDE WAGENINGEN (FWA), ZU VIELE MÄULER (ZVM)und FT an regulatorischen Sequenzen, die alle als Suppressoren der Genexpression wirken. Bei Menschen und Mäusen werden die DNA-Methylierungslevels innerhalb von Enhancern dynamisch reguliert und zeigen eine negative Korrelation mit der Enhancer-Aktivität. Dies ermöglicht die Unterscheidung von gewebespezifischen Enhancern. Im Bereich der Pflanzenbiologie ist deutlich geworden, dass die DNA-Methylierung von cis-regulatorischen Elementen dynamisch verwaltet wird, was eine zusätzliche Komplexität zu den regulatorischen Mechanismen von Pflanzen hinzufügt.
  Bitte lesen Sie den Artikel. Identifikation von DMC, DMR und DMG in der DNA-Methylierungsanalyse.
  

  Abnormale DNA-Methylierung von Enhancer-Regionen deregulieret das Transkriptionsprogramm myeloischer Neoplasien. (Ordoñez et al., 2019)

  
  Niedrige DNA-Methylierungslevels dienen oft als Indikator für aktive Enhancer. Die Bewertung der genomweiten DNA-Methylierungslevels kann effektiv durch die Technik der Bisulfit-Sequenzierung (BS-seq)In der BS-seq wird DNA mit Bisulfit behandelt, einem Prozess, der Cytosinreste (C) in Uracil (U) umwandelt. 5-Methylcytosinreste (5mC) bleiben jedoch gegenüber dieser Umwandlung resistent. Folglich behält DNA, die einer Bisulfitbehandlung unterzogen wurde, nur das methylierte Cytosin. Nach diesem Prinzip wird genomische DNA bisulfit-konvertiert, um Bibliotheken zu erstellen, und einer Hochdurchsatz-Sequenzierung unterzogen. Das Ergebnis ist die Fähigkeit, genomweite Methylierungsmuster mit einer Einzelbasenauflösung zu erkennen, indem C-T-Übergänge in den sequenzierten Reads analysiert werden. BS-seq wurde ursprünglich in Arabidopsis entwickelt und hat seitdem Anwendung in mehreren anderen Pflanzenarten gefunden.
• Chromatin-Interaktionen
  Chromatin-Interaktionen sind ein kritischer Aspekt der Genomorganisation und beeinflussen die Genregulation. Techniken wie Chromosomenkonformationsfang (3C) und seine Derivate (z. B. 4C, 5C, Hi-C, ChIA-PET usw.) bieten wertvolle Einblicke in diese Interaktionen über verschiedene genomische Regionen hinweg. Das grundlegende Konzept hinter der 3C-Technik besteht darin, Chromatin mit Formaldehyd zu kreuzvernetzen, um die dreidimensionale Struktur des Chromatins zu erhalten. Anschließend wird das Chromatin mit einer Restriktionsendonuklease (wie HindIII, BglII, SacI, BamH oder EcoRI) geschnitten. Diese Spaltung führt zur Trennung von interagierender DNA von nicht-interagierenden Genen um Proteine herum. Diese Interaktionen führen zur Bildung von zwei Arten von Schleifen: solchen zwischen denselben Genen und solchen, die reziproke Gene betreffen. Die Unterscheidung zwischen diesen beiden Schleifenarten erfolgt durch PCR-Analyse.

Durch den Einsatz von Techniken wie 3C und deren Derivaten gewinnen Forscher wertvolle Einblicke in die räumliche Organisation von Chromatin und die dynamischen Wechselwirkungen zwischen Genen, was ein tieferes Verständnis dafür bietet, wie Gene im Kontext ihrer dreidimensionalen Chromatinstruktur reguliert werden.

Referenzen:

1. Carullo, Nancy VN, und Jeremy J. Day. "Genomische Enhancer in der Gehirngesundheit und -krankheit." Gene 10.1 (2019): 43.
2. Yu, Chun-Ping, et al. "Entdeckung unbekannter Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren bei Mensch und Maus sowie deren Eigenschaften aus ChIP-seq-Daten." Mitteilungen der Nationalen Akademie der Wissenschaften 118,20 (2021): e2026754118.
3. Thibodeau, Asa, et al. "Ein auf neuronalen Netzwerken basierendes Modell sagt effektiv Enhancer aus klinischen ATAC-seq-Proben voraus." Wissenschaftliche Berichte 8.1 (2018): 16048.
4. Ordoñez, Raquel, et al. "DNA-Methylierung von Enhancer-Elementen in myeloischen Neoplasien: außerhalb der Promotoren denken?." Krebsarten 11.10 (2019): 1424.