Wie man Histonmodifikationen durch Sequenzierung nachweist?

Was sind Histonmodifikationen?

Histonmodifikationen sind komplexe chemische Veränderungen, die eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der genetischen Informationen spielen, die in der DNA gespeichert sind. Im genetischen Code ist die Sequenz der Nukleotidbasen Adenin (A), Cytosin (C), Thymin (T) und Guanin (G) fundamental. Um die DNA herum befinden sich vier zentrale Histonproteine - H2A, H2B, H3 und H4 - die zusammen eine perlenartige Struktur bilden. Diese Anordnung, bekannt als Nukleosom, dient als grundlegender Baustein der Chromatinstruktur.

Jedes Nukleosom besteht aus zwei Sätzen dieser zentralen Histone, die eine oktamere Struktur bilden. Der DNA-Strang wickelt sich um dieses Oktamer und umfasst etwa 145 bis 147 Basenpaare.

Was Nukleosomen von glatten, einheitlichen Perlen unterscheidet, sind die "Schwänze", die von den Histonen H2A, H2B, H3 und H4 ausgehen. Diese Schwänze bestehen aus spezifischen Sequenzen von Aminosäuren und unterliegen posttranslationalen Modifikationen (PTMs). Diese Modifikationen umfassen eine Reihe chemischer Veränderungen, einschließlich Methylierung, Acetylierung, Phosphorylierung, Ubiquitinierung und mehr.

Histonstruktur.

Histonmodifikationen haben einen tiefgreifenden Einfluss auf kritische DNA-abhängige Prozesse wie Chromosomenkompaktierung, Nukleosomdynamik und transkriptionale Regulation. Indem sie das Maß an Chromatin-Kompaktierung und Zugänglichkeit beeinflussen, haben diese Modifikationen einen signifikanten Einfluss auf die Genexpression. Letztendlich spielen sie eine entscheidende Rolle bei der Gestaltung aller Aspekte der biologischen Physiologie und der Entwicklungsprozesse. Im Bereich der Epigenetik gehören Histonmodifikationen zu den wichtigsten Mechanismen zur Regulierung der Genexpression in eukaryotischen Organismen.

Unter diesen Mechanismen haben Histonacetylierung und -methylierung umfangreiche Forschung erfahren und werden als zwei entscheidende und weit verbreitete epigenetische Regulationsprozesse in der Genexpression anerkannt.

Histonmethylierung

Die am gründlichsten untersuchten Histonmodifikationen umfassen Methylierung und Acetylierung. Veränderungen der Histonmethylierung werden von Histonmethyltransferasen (HMTs) und Histondemethylasen (HDMs) orchestriert. Typischerweise tritt Histonmethylierung an Arginin- und Lysin-Resten von H3 und H4 auf. Diese Reste können mono-, di- oder trimethylisiert sein, wobei Lysin auch trimethylisiert werden kann.

Die Histonargininmethylierung erhöht die Transkription, während die Lysinmethylierung an verschiedenen Positionen unterschiedliche Effekte hat, von denen einige die Genexpression fördern und andere sie hemmen. Der Grad der Methylierung verleiht ebenfalls unterschiedliche Funktionen, wie die Monomethylierung und Trimethylierung von Histon H3K4. H3K4me1 bezeichnet typischerweise transkriptionale Enhancer, während H3K4me3 Genpromotoren markiert.

Histonmethylierung. (Zhou et al., 2011)

Histonacetylierung

Die Histonacetylierung wird von Histonacetyltransferasen (HATs) und Histondeacetylasen (HDACs) gesteuert. Diese Modifikation tritt überwiegend an Lysin-Resten auf und stimuliert die Transkription von Gen-Transkripten. Das zugrunde liegende Prinzip ist, dass Acetylierungsmodifikationen die positive Ladung der Histone neutralisieren, die an die negativ geladene DNA angezogen werden. Eine höhere Acetylierung führt zu einer verringerten Bindung von Histonen an DNA, was den Zugang zur DNA für Transkriptionsfaktoren und RNA-Polymerasen erleichtert. Zum Beispiel sind H3K27ac und H3K9ac häufig mit Enhancer- und Promotoraktivität assoziiert.

Neue Histonmodifikationen

Abgesehen von den zuvor genannten konventionellen Histonmodifikationen sind in den letzten Jahren zahlreiche neue Modifikationen aufgetaucht. Dazu gehören Laktatylierung, Propionylierung, Butyrylierung, 2-Hydroxyisobutyratylierung, Succinylierung, Malonylierung, Glutarylierung, Crotonylierung und β-Hydroxybutyrylierung.

Im Jahr 2019 veröffentlichte Nature einen Bericht mit dem Titel "Metabolische Regulation der Genexpression durch Histonlaktatylierung", der die metabolische Kontrolle der Genexpression durch Histonlaktatylierung enthüllte. Diese Studie führte nicht nur das Konzept wieder ein, dass Laktat mehr als nur ein metabolisches Nebenprodukt ist, sondern betonte auch seinen Einfluss auf die epigenetischen Modifikationen des Körpers. Der Bericht brachte die Laktatylierung, eine neuartige epigenetische Modifikation, ins Rampenlicht der wissenschaftlichen Aufmerksamkeit.

Forschungsmethoden zu Histonmodifikationen: ChIP-seq

ChIP-seq, ein Akronym für Chromatin-Immunpräzipitation gefolgt von Next-Generation-Sequencing (NGS), ist eine leistungsstarke Technik an der Spitze der Epigenetikforschung. Sie integriert nahtlos die Stärken von ChIP, das gezielt Histonmodifikationen isoliert, mit der Präzision der Sequenzierung der zweiten Generation. Durch den Einsatz von Antikörpern, die auf spezifische Histonmodifikationen zugeschnitten sind, ermöglicht diese Methode die selektive Immunpräzipitation von histonmodifizierten DNA-Fragmenten. Anschließend werden diese DNA-Fragmente fragmentiert und sequenziert, wodurch die genauen Standorte und relativen Häufigkeiten von Histonmodifikationen im gesamten Genom aufgedeckt werden. ChIP-seq hat sich tatsächlich zum Goldstandard für die umfassende Aufklärung der Verteilung von Histonmodifikationen im Genom entwickelt.

Histonmodifikationen und DNA-Methylierung, als entscheidende epigenetische Marker, haben einen tiefgreifenden Einfluss auf die Chromatinarchitektur und -funktionalität. Sie sind entscheidend für die Regulierung einer Vielzahl wesentlicher biologischer Prozesse, wie Genexpression, DNA-Replikation und -Reparatur. Das komplexe Zusammenspiel zwischen diesen beiden epigenetischen Mechanismen ist entscheidend für die Aufrechterhaltung des physiologischen Gleichgewichts und von kritischer Bedeutung in verschiedenen Krankheitszuständen.

Im Gegensatz zu früheren Methoden, die separate experimentelle Ansätze zur Erkennung von Histonmodifikationen und DNA-Methylierung erforderten, ermöglicht die ChIP-seq-Technologie beispielsweise die gezielte Untersuchung von Histonmodifikationen. Ergänzende Techniken wie BS-seq werden für die präzise Erkennung von DNA-Methylierungsmustern eingesetzt. Es ist wichtig zu betonen, dass dieser innovative Ansatz nicht nur die Forschungseffizienz verbessert, sondern auch eine umfassendere Analyse epigenetischer Marker ermöglicht. Es ist wesentlich zu unterstreichen, dass traditionelle Methoden nicht nur erhebliche Probenanforderungen mit sich bringen, sondern auch nicht in der Lage sind, mehrere epigenetische Marker gleichzeitig zu bewerten.

Nanopore-Sequenzierung

Der unaufhaltsame Fortschritt der Nanopore-Sequenzierungstechnologie hat eine neue Ära der Genomforschung eingeläutet. Besonders bemerkenswert sind die verlängerten Leselängen und die Fähigkeit zur direkten Sequenzierung, die die Präzision der Identifizierung von Histonmodifikationen erheblich verbessert haben. Noch bedeutender ist, dass die Nanopore-Sequenzierungstechnologie die einzigartige Fähigkeit hat, DNA-Methylierung und Histonmodifikationen gleichzeitig zu erkennen. Sie ermöglicht das Erforschen des inhärenten Zusammenspiels zwischen diesen epigenetischen Mechanismen und deckt gleichzeitig die räumliche Anordnung dieser Marker im gesamten Genom auf, selbst bei niedrigen Sequenzierungstiefen.

Die Nanopore-Sequenzierung bietet deutliche Vorteile in Bezug auf Einfachheit, erhöhte Sensitivität und Zuverlässigkeit:

• Erkennung von Histonmodifikationen und DNA-Methylierung: Diese bahnbrechende Technologie ermöglicht die gleichzeitige Erkennung sowohl von Histonmodifikationen als auch von DNA-Methylierung auf einem einzelnen DNA-Molekül. Sie beseitigt effektiv die Notwendigkeit separater experimenteller Methoden zur Untersuchung dieser beiden unterschiedlichen epigenetischen Marker.
• Verlängerte Leselängen: Nanopore-Sequenzierung liefert verlängerte Leselängen, die die Präzision und Sensitivität der Erkennung erheblich verbessern und einen umfassenderen Blick auf epigenetische Landschaften bieten.
• Optimierter Arbeitsablauf: Die Methodik bietet ein optimiertes experimentelles Verfahren, das den gesamten Prozess von der Zellernte bis zur Bibliotheksvorbereitung an einem einzigen Tag zusammenfasst.
• Niedrigabdeckungsuntersuchung: Bemerkenswerterweise ermöglicht die Nanopore-Sequenzierung die gleichzeitige Profilierung von DNA-Methylierung und Histonmodifikationen selbst bei niedrigen Sequenzierungstiefen. Dies ist entscheidend, um die intrinsischen Verbindungen zwischen diesen beiden kritischen epigenetischen Elementen zu erforschen.

Referenz:

1. Zhou, Vicky W., Alon Goren und Bradley E. Bernstein. "Kartierung von Histonmodifikationen und der funktionalen Organisation von Säugetiergenomen." Nature Reviews Genetics 12.1 (2011): 7-18.