Was ist eine Genmutation?
Genmutationen, Veränderungen im genetischen Code, können erhebliche Auswirkungen auf das Wachstum und die Entwicklung von Organismen haben. Oft führen diese Mutationen zum Verlust der ursprünglichen Funktion des Gens, was die koordinierte Beziehung zwischen Genen und verwandten Stoffwechselprozessen stört. Die Folgen können sich als Merkmalsvariationen, abnormale individuelle Entwicklungen, reduzierte Wettbewerbsfähigkeit für Überleben und Fortpflanzung oder in extremen Fällen zu letalen Mutationen äußern.
| Mutationsart |
Beschreibung |
Mutationsart |
Beschreibung |
Empfohlene Lektüre |
| Punktmutation |
Punktmutation beinhaltet eine Veränderung in einer einzelnen Base oder Basenpaar der DNA, was zu Variationen im genetischen Code führt. |
Synonyme Mutation |
Dies tritt auf, wenn eine Basensubstitution in der kodierenden Sequenz eines Gens erfolgt. Aufgrund der Kodon-Redundanz kann jedoch das mutierte Kodon und das ursprüngliche Kodon für dieselbe Aminosäure codieren, was zu keiner Veränderung des übersetzten Proteins führt. |
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| Missense-Mutation |
In diesem Szenario führt eine Basenaustausch innerhalb der kodierenden Sequenz des Gens zu einer Änderung des Codons, was zur Kodierung einer anderen Aminosäure führt. Diese Veränderung bewirkt, dass die Polypeptidkette ihre ursprüngliche Funktion verliert, was zu Abnormalitäten im Protein führt. |
| Unsinnsmutation |
Eine Mutation in der kodierenden Sequenz des Gens bildet eines der drei Stopcodons (UAG, UAA, UGA). Diese Mutation führt zur vorzeitigen Beendigung der Proteinsynthese, was zu einem verkürzten Protein führt. Diese Verkürzung kann potenziell die Funktion des Proteins beeinträchtigen oder vollständig stören. |
| Einfüge-Löschmutation (Indel) |
Indel umfasst die Einfügung oder Löschung einer bestimmten Länge von Nukleotiden an einer bestimmten Stelle im Genom. |
Frameshift (fs) |
Dies geschieht, wenn eine oder mehrere Basen, die keine ganzzahligen Vielfachen von 3 sind, in den DNA-Strang eingefügt oder gelöscht werden. Dies stört den Leserahmen im kodierenden Bereich, verändert die Sequenz der Basen und führt zu Veränderungen in den übersetzten Aminosäuren. |
| Nicht-Shift-Mutation |
Wenn eine oder mehrere Basen in einem ganzzahligen Vielfachen von 3 in einem DNA-Strang eingefügt oder gelöscht werden, wird die Sequenz der Basen im kodierenden Bereich verändert. Dies führt zu einer Änderung der übersetzten Aminosäure, ohne den Leserahmen zu stören. |
| Dynamische Mutation |
Dynamische Mutation, auch bekannt als instabile Trinukleotid-Wiederholungssequenzmutation, wird durch die Amplifikation von Trinukleotidwiederholungen in der kodierenden Sequenz des Gens oder in angrenzenden Sequenzen verursacht. Die Anzahl der repetitiven Amplifikationen kann über Generationen hinweg zunehmen und zeigt einen kumulativen Mutations-Effekt, daher der Begriff dynamische Mutation. Häufig bei verschiedenen genetischen Störungen wie der Huntington-Krankheit, dem fragilen X-Syndrom, der spinozerebellären Ataxie und der ankylosierenden Muskeldystrophie. |
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Modernste Technologien wie Hochdurchsatz-Sequenzierung und Langlese-Sequenzierung, die von CD Genomics eingesetzt werden, ermöglichen die robuste Analyse von Genmutationen. Dieser fortschrittliche Sequenzierungsansatz erlaubt eine umfassende und effiziente Untersuchung genetischen Materials und bietet wertvolle Einblicke in die molekulare Landschaft sowie potenzielle Biomarker, die mit verschiedenen Erkrankungen in Verbindung stehen.
Klassifizierung von Mutationen
Mutationen werden basierend auf ihren Ursprüngen in zwei Haupttypen klassifiziert: spontane und induzierte Mutationen, die jeweils aus unterschiedlichen Ursachen entstehen. Spontane Mutationen umfassen solche, die natürlich auftreten, bedingt durch Faktoren wie natürliche Mutagene oder Fehler während der DNA-Replikation und -Reparatur. Induzierte Mutationen hingegen resultieren aus der absichtlichen Verwendung von künstlichen Mutagenen. Mutagene treten in verschiedenen Formen auf, darunter physikalische Mutagene wie ionisierende Strahlung und ultraviolettes Licht, chemische Mutagene wie Nitrit und Ethidiumbromid sowie biologische Mutagene wie Retroviren.
Eine weitere Kategorisierung von Mutationen basiert auf den Zellen, die für ihre Produktion verantwortlich sind. Somatische Zellmutationen und Keimzellmutationen sind zwei Haupttypen. Somatische Zellmutationen, die in nicht-reproduktiven Zellen entstehen, werden nicht direkt an die nächste Generation weitergegeben. Im Gegensatz dazu haben Keimzellmutationen, die in reproduktiven Zellen auftreten, eine höhere Wahrscheinlichkeit, an den Nachwuchs vererbt zu werden.
Eine andere Perspektive zur Kategorisierung betrachtet die Regionen, die Mutationen hervorrufen. Auf zellulärer Ebene beinhalten chromosomale Mutationen Veränderungen in der Anzahl und Struktur der Chromosomen innerhalb einer Zelle. Auf molekularer Ebene hingegen beinhalten genetische Mutationen Veränderungen in der Zusammensetzung und Sequenz der Basen innerhalb von Genen.
Merkmale der Mutation
Die Wahrnehmung von Mutationen als schädlich oder vorteilhaft ist relativ, und in bestimmten Fällen können sich ihre Auswirkungen verändern. Zum Beispiel kann eine Resistenzmutation als vorteilhaft angesehen werden, wie man bei Pflanzen mit Zwergmutanten sieht, die in windigen und hochdüngenden Umgebungen gedeihen.
- Die Häufigkeit und Seltenheit von Genmutationen
Genmutationen sind im biologischen Bereich allgegenwärtig und treten sowohl bei niederen als auch bei höheren Organismen durch natürliche und künstliche Mittel auf. In ihrem natürlichen Zustand sind Mutationen jedoch äußerst selten, wobei Wildtyp-Gene eine sehr niedrige Mutationsrate aufweisen.
- Zufälligkeit und ungerichtete Natur von Genmutationen
a. Zufälligkeit an Ort: Genmutationen können in somatischen Zellen und Keimzellen auftreten, wobei erstere in der Regel nicht an Nachkommen weitergegeben werden und letztere potenziell vererbt werden können. Mutationen können in verschiedenen Teilen desselben DNA-Moleküls oder in unterschiedlichen DNA-Molekülen innerhalb einer Zelle auftreten.
b. Zufälligkeit in der Zeit: Genmutationen können in jeder Phase der biologischen Entwicklung eines Individuums auftreten und sind möglicherweise anfälliger bei älteren Menschen, wie zum Beispiel bei älteren Menschen, die anfällig für Hautkrebs sind.
c. Nicht-Richtungsgebundenheit: Genmutationen können in mehrere Richtungen auftreten, was zu verschiedenen Allelformen innerhalb eines Gens führt.
- Wiederholbarkeit und Umkehrbarkeit von Genmutationen
a. Wiederholbarkeit: Mutierte Gene können unter bestimmten Bedingungen unabhängig zusätzliche Mutationen durchlaufen und dabei neue Allelformen mit einer bestimmten Häufigkeit bilden.
b. Umkehrbarkeit: Die Richtung der Genmutation ist umkehrbar.
- Parallelismus der Genmutation
Eng verwandte Arten durchlaufen oft ähnliche Genmutationen aufgrund ihrer relativ nahen genetischen Grundlagen.
Einflussfaktoren
- Physikalische Faktoren: Exposition gegenüber Gammastrahlen, ultravioletten Strahlen usw.
- Chemische Faktoren: Anwesenheit von Basenanaloga, Aflatoxin usw.
- Biologische Faktoren: Einfluss bestimmter Viren und Bakterien usw.
- Änderung der Anzahl, Reihenfolge und Art der Desoxyribonukleotide innerhalb eines Gens, was zu Veränderungen der genetischen Information führt.
Mutationsnachweis-Technologie
ARMS-PCR
Amplifikation Refraktäre Mutationssystem PCR (ARMS-PCR), auch bekannt als Allelspezifische PCR (AS-PCR), verwendet einen ausgeklügelten Ansatz zur Kontrolle der allelspezifischen Verlängerung durch das strategische Design von 3'-Ende-Primern. Durch die Integration dieses Primerdesigns mit der Taqman Die Probenmethode identifiziert die Wildtypallele sowie Mutationen genau.
In dem ARMS-PCR-Prozess werden charakteristische Nukleotide am 3'-Ende der beiden Upstream-Primer, die jeweils einem Allel entsprechen, eingebaut, wobei ein Primer spezifisch für den Wildtyp und der andere für den Mutanten ist. Während der Amplifikation kann der Upstream-Primer, der keine perfekte Übereinstimmung mit der Vorlage hat, keine komplementären Basenpaare bilden, was zu Fehlpaarungen, blockierter Verlängerung und dem Fehlen der PCR-Produktgenerierung führt. Im Gegensatz dazu amplifiziert das Primer-System, das genau mit der Vorlage übereinstimmt, erfolgreich die entsprechenden PCR-Produkte. Die an die fluoreszierenden Gruppen angehängten TaqMan-Sonde erzeugen nachweisbare Signale, die eine Genotypbestätigung durch die Analyse von Fluoreszenzdaten ermöglichen. Dieser sorgfältige Ansatz gewährleistet die genaue Identifizierung von Wildtypallelen und Mutantengenen in den untersuchten Proben.
Mutantenanreicherung-PCR
Die Mutantenanreicherung-PCR ist ein zweistufiger Amplifikationsprozess, der für die gezielte Anreicherung mutierter EGFR-Gene entwickelt wurde. Im ersten Schritt wird das Wildtyp-EGFR-Gen einer selektiven Verdauung mit einem Restriktionsendonuklease unterzogen. Dieser Prozess reichert das mutierte EGFR-Gen an und ebnet den Weg für die zweite PCR-Amplifikation. Anschließend werden die PCR-Produkte durch Elektrophorese nachgewiesen, und der Mutationsstatus des EGFR-Gens wird anhand spezifischer Merkmale der PCR-Produkte, wie Größe oder Vorhandensein/Nichtvorhandensein, bestimmt.
Im Vergleich zur direkten Sequenzierungsmethode weist die Mutant Enrichment PCR eine erhöhte Sensitivität und Spezifität bei der Erkennung von EGFR-Aktivierungsmutationen auf. Bemerkenswerterweise kann sie ein mutiertes Gen sogar in Anwesenheit von 10^3-10^4 Wildtyp-Kopien unterscheiden. Es ist jedoch wichtig, bestimmte Nachteile anzuerkennen, die diesem Verfahren innewohnen. Die Notwendigkeit für zwei PCR-Amplifikationen und die Enzymverdauung macht das Verfahren kompliziert, zeitaufwendig und anfällig für Kontamination. Trotz dieser Herausforderungen macht die verbesserte Sensitivität und Spezifität die Mutant Enrichment PCR zu einem wertvollen Werkzeug für die genaue Erkennung von EGFR-Genmutationen.
Sanger-Sequenzierung
Sanger-Sequenzierung hebt sich als eine der am häufigsten verwendeten Methoden zur Mutationsdetektion hervor. Ihr grundlegendes Prinzip basiert auf der Nutzung von DNA-Polymerase, Primern, dNTP und dem strategischen Auslassen eines zufälligen ddNTP während des PCR-Amplifikationsprozesses. Dieses ddNTP, das als Ersatz für dNTP fungiert, nimmt an der Reaktion zur DNA-Strangsynthese teil und wird zufällig an bestimmten Positionen in den DNA-Strang eingebaut, wodurch die kontinuierliche Verlängerung des DNA-Strangs behindert wird.
Durch diesen Ansatz werden eine Reihe von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Längen erzeugt. Diese Fragmente werden anschließend fluoreszenzmarkiert und einer elektrophoretischen Trennung unterzogen, was zu deutlichen fluoreszierenden Bändern führt. Das endgültige Ergebnis ist die Identifizierung des DNA-Fragments, das die Mutationsstelle enthält. Sanger-SequenzierungDie Präzision liegt in der Fähigkeit, ein umfassendes Profil von DNA-Fragmenten zu erstellen, was eine genaue Lokalisierung von Mutationen innerhalb der sequenzierten DNA-Stränge ermöglicht.
Pyrophosphat-Sequenzierung
Pyrophosphatsequenzierung stellt einen bahnbrechenden Fortschritt in der Technologie der DNA-Sequenzanalyse dar. Das zugrunde liegende Prinzip umfasst einen einzigartigen Sequenzierungsansatz, bei dem in jedem Sequenzierungsreaktionszyklus nur ein einzelner Typ von dNTP eingeführt wird. Wenn dieses spezifische dNTP erfolgreich mit der Vorlage paart, integriert die Polymerase es in den neu synthetisierten DNA-Strang und setzt die Pyrophosphatgruppe (PPi) frei. Durch eine Kaskade enzymatischer Chemilumineszenzreaktionen wird PPi in ein sichtbares Signal umgewandelt, dessen Intensität direkt proportional zur Anzahl der in der Reaktion eingebauten Nukleotide ist.
Diese Technologie ermöglicht die schnelle und präzise Bestimmung kurzer Zielfragmente ohne die Notwendigkeit von Elektrophorese oder fluoreszierender Markierung von DNA-Fragmenten. Trotz ihrer Effizienz ist es erwähnenswert, dass die Pyrophosphat-Sequenzierung noch nicht das gleiche Maß an Popularität wie die direkte Sequenzierung erreicht hat. Dies wird hauptsächlich auf die begrenzte Leseweite und die Anfälligkeit für Kontaminationen zurückgeführt. Dennoch positioniert ihre einzigartige Methodik sie als vielversprechende Alternative für bestimmte Anwendungen in der DNA-Sequenzanalyse.
Next-Generation Sequencing (NGS)
Fortschritte in Next-Generation Sequencing (NGS) hat es als transformative Kraft vorangetrieben und bietet drei wesentliche Vorteile gegenüber der traditionellen Sanger-Sequenzierung. Diese Vorteile umfassen eine hohe Durchsatzrate, den Austausch von bakteriell klonierten DNA-Fragmenten durch vielseitige DNA-Bibliotheken und die Eliminierung der Elektrophorese aus dem Sequenzierungsprozess. Dieser Paradigmenwechsel reduziert erheblich die Zeit- und Arbeitskosten, die mit der Sequenzierung verbunden sind.
Empfohlene Lektüre: Illumina Next-Generation Sequencing (NGS): Prinzipien und Arbeitsablauf.
In den letzten zwei Jahrzehnten, NGS hat weit verbreitete Popularität erlangt, insbesondere aufgrund seiner entscheidenden Rolle bei der Identifizierung zahlreicher Mutationen und chromosomaler Varianten, die mit Krankheiten verbunden sind. Im Bereich der krankheitsbezogenen Genmutationen hat NGS die Krebsforschung und klinische Diagnostik in die genomische Ära geführt und die Vision der personalisierten Medizin basierend auf den Merkmalen von Tumormutationen verwirklicht.
NGS-Anwendungen in Krebs-Kliniken umfassen ein Spektrum von Techniken, einschließlich Whole-Genome-Sequenzierung (WGS)Whole-Exom-Sequenzierung (WES) gezielte Genpanel-Sequenzierung (TS), Transkriptom-Sequenzierung, epigenetische Sequenzierung und Einzelphasen-Sequenzierung. Unterschiede zwischen WGSWGS deckt das gesamte Genom umfassend mit einer Rate von etwa 95%-98% ab, während WES und TS selektiv DNA-Fragmente aus gesamten Exomen oder spezifischen Zielgenen erfassen und sequenzieren. Da nur etwa 2% des menschlichen Genoms aus kodierenden Sequenzen bestehen, WES und TS verbessern strategisch die Sequenzierungstiefe auf kosteneffiziente Weise und bewahren dabei Genauigkeit und Effizienz.
Die Mehrheit der kommerziell eingesetzten NGS-Anwendungen im Zusammenhang mit Krebs nutzt die TS-Methode, um Sequenzen von krebsbezogenen Genen zu erfassen oder epigenetische Informationen zu gewinnen. Die kontinuierliche Entwicklung und weitverbreitete Akzeptanz von NGS-Detektionstheorien und -technologien im Zusammenhang mit Krebs haben ihre praktischen Anwendungen in verschiedenen klinischen Phasen erweitert. Diese Anwendungen umfassen nun die frühzeitige Krebsfrüherkennung, die Erkennung von minimaler Resterkrankung (MRD) nach der Operation und die gleichzeitige Diagnostik für Patienten, die mit fortgeschrittenen Krebserkrankungen kämpfen.
Bitte lesen Sie unseren Artikel. Next-Generation-Sequencing zur Entdeckung von Krebs-Biomarkern.
Einzelmolekül-Langlese-Technologie
Die innovative Einzelmolekül-Langlese-Technologie hat erhebliche Vorteile bei der Erkennung von Genmutationen, insbesondere bei der Analyse von "schwierigen Sequenzen", die für herkömmliche Techniken eine Herausforderung darstellen. Dazu können GC-reiche kurze tandemwiederholungen (STRs) und STRs gehören, die aus sich wiederholenden Sequenzmotiven bestehen, die vom Referenzgenom abweichen.
Eine Schlüsselstärke der Einzelmolekül-Langzeit-Sequenzierung liegt in ihrer Fähigkeit, die PCR-Amplifikation zu umgehen, was eine umfassende Abdeckung des gesamten Genomgebiets ermöglicht, insbesondere in wiederholt amplifizierten Bereichen. Dieser Ansatz gewährleistet eine gründliche Erkundung des gesamten Bereichs der Wiederholungsamplifikation, ohne die mit PCR verbundenen Einschränkungen. Darüber hinaus liefert die Technologie umfassendere Ergebnisse, die die Gesamtheit der Wiederholungssequenzen, Details zu amplifizierten Wiederholungs-längen, die Anzahl der Wiederholungseinheiten und deren Verteilung umfassen.
Die hohe Auflösung dieser Technologie ist besonders bemerkenswert, da sie präzise Informationen über unterbrochene Sequenzen in der Nähe von krankheitsverursachenden Wiederholungen liefert. Diese Unterbrechungen können als wertvolle Marker für die Behandlung und Prognose von Krankheiten dienen. Daher, Einzelmolekül-Langlese-Technologie wird voraussichtlich eine entscheidende Rolle bei molekularen Diagnosen im Zusammenhang mit STR-Amplifikationsanomalien spielen. Ihre Anwendung verspricht eine verbesserte Sensitivität und Spezifität für dynamische Erkrankungen und bietet Patienten und ihren Nachkommen detailliertere diagnostische und therapeutische Einblicke.
Richtlinien zur Einreichung von Proben
