Next-Generation-Sequenzierung zur Entdeckung von Krebs-Biomarkern

Was sind Biomarker?

Biomarker sind wichtige molekulare, chemische oder zelluläre Merkmale, die objektiv gemessen werden können und zur Beschreibung biologischer Prozesse, pathologischer Zustände und Reaktionen auf Behandlungen verwendet werden. Biomarker können krankheitsbezogen oder behandlungsbezogen sein. Krankheitsbezogene Biomarker sind diagnostisch (werden verwendet, um den Krankheitszustand zu bestimmen), prognostisch (geben Informationen über potenzielle klinische Ergebnisse, unabhängig von der Behandlung) oder prädiktiv (geben Informationen über potenzielle klinische Ergebnisse als Reaktion auf eine spezifische Behandlung).
Damit ein Biomarker für die klinische Anwendung akzeptabel ist, muss er die folgenden Eigenschaften aufweisen:
1. leicht und konsistent in biologischen Flüssigkeiten, Geweben oder anderen biologischen Proben nachweisbar sein
2. schnell nachweisbar und stabil sein.
3. Hohe Sensitivität und Spezifität.
4. Starke Korrelation mit dem Phänotyp oder Ergebnis von Interesse.
5. Kann durch einfache, nicht-invasive und kostengünstige Tests nachgewiesen werden.
6. Keine geschlechtsspezifischen

Stattdessen sollten Krebsbiomarker spezifisch für den Krebsuntertyp sein, Informationen über das metastatische Potenzial des Krebses liefern und auch in archivierten Proben wie FFPE (formalinfixiertes, paraffineingebettetes Gewebe) nachweisbar sein. Da Krebs durch genetische Abweichungen verursacht wird und eine heterogene Erkrankung ist, können molekulare Biomarker wie genetische Varianten, Genexpressionsprofile und in einigen Fällen der genomische Methylierungsstatus, handlungsrelevantere Einblicke bieten als traditionelle Marker. Sequenzierungstechnologien In der Lage, Millionen von Reaktionen parallel durchzuführen, haben sie großes Potenzial für die Detektion von Biomarkern und deren Anwendungen.

NGS in der Entdeckung von Krebs-Biomarkern

Sequenzierungstechnologien, insbesondere NGS, sind unvoreingenommen, vollständig und detailliert darin, die Heterogenität von Krebs und die sich schnell verändernde genetische Landschaft im Krebs zu erfassen, und können die Chancen zur Identifizierung umsetzbarer genetischer Abweichungen erheblich verbessern. Neben der Erkennung von Veränderungen in DNA-Sequenzen kann NGS auch für die Transkriptomanalyse und die Methylierungsdetektion verwendet werden. Das Cancer Genome Atlas (TCGA) ist eine Tumorgenom-Initiative, die 2006 vom National Cancer Institute und dem National Human Genome Research Institute ins Leben gerufen wurde, um hochdurchsatzgenomische Analysetechnologien zu nutzen, um das Verständnis von Tumoren zu verbessern und die Prävention, Diagnose und Behandlung von Tumoren zu verbessern. Derzeit enthält TCGA bereits Informationen zu Sequenzierungsergebnissen, Transkriptomanalysen, Kopienzahlvarianten, DNA-Methylierung und einzelnen Nukleotidvarianten und deckt 33 Tumortypen ab.

5 Arten von Biomarkern, die durch NGS identifiziert werden können

• Genetische Varianten

Mutationen in Form von einzelnen Nukleotidvarianten, Insertionen, Deletionen und anderen strukturellen Varianten sind mit der Krebsentwicklung, dem Fortschreiten der Krankheit und dem metastatischen Potenzial sowie der Wirksamkeit von Behandlungen verbunden. Zum Beispiel wurden Mutationen in BRCA1/2, KRAS, PTEN und anderen als prognostische und prädiktive Marker identifiziert. NGS-basierte Tests kann daher verwendet werden, um bekannte und neue Krebsmutationen zu erkennen. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von NGS für Biomarker-Tests ist, dass genetisches Material aus archivierten Proben wie FFPE-Blöcken ebenfalls verwendet werden kann.

Während genetische Aberrationen in einzelnen Genen die Arzneimittelentwicklung und Diagnose informieren können, weisen Krebszellen oft Mutationswege in mehreren Genen auf, was eine detailliertere Mutationslandschaft von großem Wert macht. Einige NGS-Panels, die auf der Grundlage a priori Wissen entwickelt wurden, sind jetzt in der Lage, Dutzende von krebsassoziierten Genen gleichzeitig zu erkennen, wie es bei der Mehrheit der Patienten mit BRCA1/2-Mutationen der Fall ist. Darüber hinaus haben viele der in den letzten zehn Jahren von der FDA zugelassenen Krebsmedikamente spezifische genetische Aberrationen ins Visier genommen. Zum Beispiel wurde Gefitinib für Lungenadenokarzinom mit einer EGFR-Mutation zugelassen, und Vemurafenib wurde für Melanom-Patienten mit einer V600E BRAF-Mutation zugelassen.

Top-Gene als Krebs-Biomarker. (Lever J et al., 2019)

• Genexpressionsprofilierung

Es gibt viele Isoformen eines Gens, und eine große Anzahl von Studien hat gezeigt, dass spezifische Genisoformen in Krebs auf veränderte Weise exprimiert werden. Transkriptomanalyse mit NGS hat sehr ausgeprägte Vorteile, da die Expressionsdaten auf Isoformebene erfasst werden, was einzigartige und wichtige Einblicke in das Fortschreiten von Krebs und Metastasen bieten kann. Brustkrebs, Darmkrebs und Glioblastom sind Beispiele für Krebsarten, bei denen die Genexpressionsprofilierung weit verbreitet ist. Darüber hinaus erfolgt die Biomarkeranalyse durch Vollblut. RNA-Seq ermöglicht die Analyse von Ausdrucksunterschieden in Blutproben, wie zum Beispiel bei der fortschrittlicheren Flüssigbiopsie, die einen Bluttest anstelle eines Tumorgewebetests darstellt und Referenzen sowie Einblicke zur Überwachung von Krebsrückfällen und zur Bewertung der Wirksamkeit bieten kann.

• Epigenetische Modifikationen

Epigenetische Modifikationen sind DNA-Veränderungen, die unabhängig von Variationen in der DNA-Sequenz sind. Epigenetische Modifikationen wie DNA-MethylierungHiston-Acetylierung und -Methylierung haben tiefgreifende Auswirkungen auf die Genexpression und sind klassische Biomarker, die für die Krebsdiagnose und die Entwicklung therapeutischer Interventionen verwendet werden können. Beispiele für epigenetische Modifikationen, die als Biomarker verwendet werden, sind die Hypermethylierung von GSTP1 bei Prostatakrebspatienten und DAPK sowie die Hypermethylierung des RASSF1A-Gens bei Blasenkrebs. Hochdurchsatztechnologien wie Epigenom-Sequenzierung sind gut geeignet, epigenetische Modifikationen als Biomarker bei Krebs zu identifizieren.

• MikroRNA

Mikro-RNAs sind kleine (19-22 Nukleotide lange) einzelsträngige RNA-Moleküle, die eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der Genexpression spielen, indem sie mRNA zur Degradation anvisieren oder die Translation hemmen. Die durch Mikro-RNAs vermittelte Regulation der Genexpression ist wichtig für die Entwicklung, Differenzierung und das Zellwachstum, und daher Mikro-RNAs könnte eine Schlüsselrolle bei der Karzinogenese spielen. miR15 und miR16 haben sich als wichtig für die chronische lymphatische Leukämie (CLL) erwiesen. miR206 ist in 93 % der Brustkrebsfälle herunterreguliert. Die Rolle von Mikro-RNA im Krebs ist ein sehr aktives Forschungsgebiet, und es ist wahrscheinlich, dass viele Schlüssel-moleküle noch entdeckt werden müssen.

Mikro-RNAs bei Krebs (Hayes J et al., 2014)

• Zirkulierende Tumor-DNA

Zirkulierende Tumor-DNA (ctDNA) bezieht sich auf die Freisetzung von somatischer DNA aus Tumorzellen in den Blutkreislauf, entweder durch Abstoßung oder wenn Apoptose auftritt. ctDNA ist der DNA-Fragment aus dem Tumorgenom, das ständig im menschlichen Blutkreislauf zirkuliert und bestimmte Merkmale (einschließlich Mutationen, Deletionen, Insertionen, Umlagerungen, Abweichungen in der Kopienzahl, Methylierung usw.) trägt. Zirkulierende Tumor-DNA ist cfDNA (zellfreie DNA), die von Tumorzellen stammt und zu einer Art von cfDNA gehört. Derzeit wird häufig eine Multigen- oder sogar eine Ganzgenomanalyse von ctDNA-Proben durchgeführt, die verwendet wird. NGS, die die Erkennung verschiedener Mutationen, einschließlich ALK-Fusionen mit ROS1, durch den Einsatz von RNA-Sondenfangtechniken ermöglicht.

ctDNA als Krebs-Biomarker (Pessoa L S et al., 2020)

Herausforderungen der NGS bei der Entdeckung von Krebs-Biomarkern

• Varianten mit unbestimmter Bedeutung

Varianten von unbestimmter Bedeutung (VUS) sind DNA-Varianten, deren funktionale Auswirkungen nicht vollständig charakterisiert sind. Das Vorhandensein von VUS in genomischen Regionen, die für die betrachtete Krankheit wichtig sind, kann eine große Unsicherheit bei der Bestimmung zukünftiger Maßnahmen schaffen und kann daher manchmal kontraproduktiv sein. Tests zur Identifizierung von Biomarkern sollen präzise und spezifische Informationen liefern, die zuverlässig zur Steuerung des Krankheitsmanagements verwendet werden können, und durch NGS identifizierte VUS stellen eine erhebliche Herausforderung für ihre Nützlichkeit als Standardtests dar.

• Komplexe Datenanalyse und -interpretation

Im Kontext der Entdeckung von Krebs-Biomarkern erzeugt NGS riesige Mengen komplexer Daten, einschließlich genetischer Variationen, Genexpressionsmuster und epigenetischer Modifikationen. Diese Komplexität kann die Datenanalyse und -interpretation herausfordernd gestalten, insbesondere für Forscher ohne spezialisierte computer- und statistische Fähigkeiten. Darüber hinaus ist die Entwicklung robuster und zuverlässiger bioinformatischer Werkzeuge für die Analyse und Interpretation von NGS-Daten unerlässlich. Diese Werkzeuge müssen in der Lage sein, genetische Varianten genau zu identifizieren und zu annotieren, ihre funktionalen Auswirkungen vorherzusagen und diejenigen zu priorisieren, die am wahrscheinlichsten klinisch relevant sind.

Referenzen:

1. Desai A N, Jere A. Next-Generation-Sequenzierung zur Entdeckung von Krebs-Biomarkern[J]. Next Generation Sequencing in Cancer Research, Band 2: Von Basenpaaren zu Betten, 2015: 103-125.
2. Pessoa L S, Heringer M, Ferrer V P. ctDNA als Krebsbiomarker: Ein umfassender Überblick[J]. Kritische Bewertungen in Onkologie/Hämatologie, 2020, 155: 103109.
3. Lever J, Jones M R, Danos A M, et al. Text-Mining klinisch relevanter Krebsbiomarker zur Kuratierung in die CIViC-Datenbank[J]. Genome Medicine, 2019, 11: 1-16.
4. Hayes J, Peruzzi P P, Lawler S. MikrorNAs bei Krebs: Biomarker, Funktionen und Therapie[J]. Trends in der molekularen Medizin, 2014, 20(8): 460-469.