Strategien zur Minderung häufiger DNA-Kontaminationen in der mikrobiellen Sequenzierung

Das Gebiet der Forschung zu mikrobiellen Gemeinschaften hat unser Verständnis der Mikrobiologie revolutioniert, doch das weit verbreitete Problem der DNA-Kontamination kann die Integrität von Experimenten beeinträchtigen, von der ersten Probenahme bis zur finalen Sequenzierung. Kontaminanten können während verschiedener Schritte in DNA-Proben eindringen. mikrobiologische Forschungeinschließlich DNA-Extraktion, PCR-Amplifikation und sogar Laborreagenzien, was letztendlich die Ergebnisse verzerrt. Insbesondere kann DNA-Kontamination schädlich sein, wenn Proben mit minimalen mikrobiellen Lasten untersucht werden, was sorgfältige Maßnahmen zur Bewältigung dieser Herausforderung erforderlich macht.

Quellen von DNA-Kontamination

Die potenziellen Quellen für DNA-Kontamination sind vielfältig und umfassen molekularbiologisch reines Wasser, PCR-Reagenzien und die DNA-Extraktionskits selbst. Um Kontaminationsniveaus zu erkennen und zu quantifizieren, werden negative Kontrollen, oft als "leere" DNA-Extraktions- und anschließende PCR-Amplifikationsproben bezeichnet, routinemäßig in mikrobielle Sequenzierung Experimente. Interessanterweise zeigen diese negativen Kontrollproben typischerweise ein Spektrum kontaminierender Bakterienarten, das dem Hintergrund entspricht, der in Proben menschlichen Ursprungs gefunden wird, die zusammen mit derselben Charge von DNA-Extraktionskits verarbeitet wurden.

Eine Untersuchung dieser negativen Kontrollresultate zeigt häufig gemeinsame taxonomische Klassifikationen an verschiedenen Laborstandorten. Zu den wiederkehrenden Kontaminanten gehören Acidobacteria Gp2, Burkholderia, Mesorhizobium, und PseudomonasDiese Ähnlichkeiten deuten darauf hin, dass es Unterschiede in den Schadstoffkonzentrationen zwischen den Laboren gibt, die möglicherweise aus Unterschieden in Reagenzien, Kit-Chargen oder sogar aus Verunreinigungen resultieren, die in die Laborumgebung eingeführt werden.

Zusammenfassung der taxonomischen Zuordnung durch 16S rRNA-Gen-Sequenzierung aus zehnfach verdünnten reinen Kulturen und Kontrollen. (Salter et al., 2014)

Auswirkungen kontaminierter Extraktionskits auf Studien mit niedriger Biomasse

Um die Schwere des Problems zu veranschaulichen, betrachten wir einen spezifischen Fall. Nasopharyngeal-Abstriche wurden eingesetzt, um die Entwicklung der nasopharyngealen Mikrobiota bei Säuglingen zu untersuchen. Die Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) offenbarte zwei unterschiedliche Taxa, wobei die Proben, die in den ersten sechs Lebensmonaten entnommen wurden, deutlich von denen unterschieden werden konnten, die zu späteren Zeitpunkten entnommen wurden. Diese Erkenntnis unterstreicht die Korrelation zwischen der nasopharyngealen Bakterienflora und der Entwicklungszeit. Ein entscheidender Faktor trat jedoch auf, als vier verschiedene Chargen von DNA-Extraktionskits verwendet wurden. Die Wahl des Kits beeinflusste die Gemeinschaftsmerkmale der Proben erheblich, wobei die Mehrheit der Probenlesungen von den ersten beiden verwendeten Kits stammte.

Zusammenfassung des Kontaminationsgehalts von nasopharyngealen Proben aus Thailand. (Salter et al., 2014)

Empfehlungen

Angesichts der tiefgreifenden Auswirkungen von bakterieller DNA-Kontamination auf mikrobiologische Studien, insbesondere bei Proben mit niedrigem mikrobiellem Biomasse, ergeben sich eine Reihe von wichtigen Empfehlungen:

Kit-Konsistenz: Um die durch die Kits selbst eingeführte Kontamination zu minimieren, wird dringend empfohlen, während eines Projekts durchgehend dieselbe Charge von DNA-Extraktionskits zu verwenden. Diese Praxis gewährleistet Einheitlichkeit und beseitigt das Risiko von durch die Kits verursachten Variationen in den Ergebnissen.

Schlussfolgerung

Der Kampf gegen DNA-Kontamination in mikrobielle Sequenzierung ist ein fortlaufendes Unterfangen, das für die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit von Mikrobiota-Studien von entscheidender Bedeutung ist. Durch das Verständnis der Kontaminationsquellen, das Erkennen ihrer Auswirkungen auf die Ergebnisse und die Umsetzung von Maßnahmen wie der Konsistenz von Kits können Forscher die Integrität ihrer Forschung zur mikrobiellen Gemeinschaft schützen, selbst wenn sie mit Proben mit geringer mikrobieller Biomasse arbeiten. Dieser Ansatz wird letztendlich zu genaueren und verlässlicheren Ergebnissen führen und unser Verständnis der Mikrobiologie weiter vorantreiben.

Referenz:

1. Salter, Susannah J., et al. "Reagenzien- und Laborverunreinigungen können die sequenzbasierte Mikrobiomanalyse erheblich beeinträchtigen." BMC Biologie 12 (2014): 1-12.